放线菌次级代谢途径的设计

《生物工程进展》1999,V o l.19,N o.5

放线菌次级代谢途径的设计

周　军　唐雅君　张惠展

(华东理工大学生化工程系　上海　200237)

摘要　近来有关放线菌次级产物生物合成的分子遗传学和生物化学方面的进展为我们改造其代谢途径提供了一个明确的方向。近年来,对微生物的初级代谢途径进行基因改造取得了成功,但放线菌的次级代谢工程产物却都没有达到中试或生产规模。进展如此缓慢的主要原因是放线菌自身复杂的代谢途径以及细胞循环中复杂的调节方式及其特异性。目前人们着力于通过基因操作改造酶,从而重新设计以其催化产物为基本骨架的代谢途径,最终产生修饰的或新的天然终产物。本文将讨论达到此目的的几种设计策略。

关键词　放线菌　次级代谢　抗生素　代谢工程　62脱氧己糖代谢　多聚链　肽。

前言

所谓代谢工程(m etabo lic engineering)指的是通过改变细胞内的生化途径产生目的代谢产物的生物技术,使天然终产物过量生产或合成新产物,其中新产物可能是传统途径中的中间产物或经修饰的终产物[1]。近年来,由于DNA重组技术的发展,使得用基因技术改造代谢途径成为可能。代谢工程的特点是对分解代谢和合成代谢中多步催化反应进行定向的遗传改变。

目前,对微生物初级代谢途径的生化改造已有成功的例子,如:(1)通过引入编码依赖NAD PH的2,52二酮2D2葡萄糖酸(2,52D KG)还原酶基因产生了欧文氏菌属突变株;[2](2)通过多拷贝载体增强使终产物脱敏的32脱氧2 D2阿拉伯糖2景天糖酸酶基因以及编码分枝变位酶和预苯酸脱水酶等代谢分支点基因(它们对L2色氨酸和L2苯丙氨酸的反馈抑制不敏感)的表达,构建了高产L2色氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株,该菌株同时可大量产生L2苯丙氨酸[3];(3)导入木聚糖醇基因获得了将半纤维素转化成乙醇的大肠杆菌工程菌[4]。与初级代谢相反,放线菌次级代谢产物或菌株都没有达到中试或生产规模,在此领域进展缓慢的主要原因是放线菌代谢途径的复杂性、菌株特异性(大部分情况下一种途径仅存在于某一特定种类的少数菌株中)以及遗传不稳定性。

1　放线菌次级代谢产物生物合成途径的特性

放线菌可以产生相当多的低分子量次级代谢物。迄今为止,大约上万种生物活性物质(如抗生素)中的三分之二是由放线菌产生的,这与其自身的生理特性是分不开的。在放线菌生活周期中,营养细胞分化成气生菌丝和孢子时,需要大量丰富多彩的次级代谢来合成各种控制分化和细胞周期的专一性物质,并且次级代谢在细胞进化过程中不断被优化改造,这种改造过程的特征是生物合成途径中新基因组的形成,酶蛋白的功能转换及某种现存基因或酶的缺失,结果产生了为数众多的代谢物家族。细菌细胞内终产物的多样性是由以下因素决定的:(1)各种形式的酶催化功能向不同方向演变;(2)代谢途径发生多样性异化;(3)产生新产物的生物合成基因重新组合。次级代谢的途径可能是线性的(所有反应都发生于一个前体),也可能是分支的(两个或多个前体缩合之前被活化或修饰过)。一般说来,绝大多数不同的次级代谢途径基本上包括:(1)由细胞中间代谢活化前体生成的各种次级代谢产物;(2)以均一、不

均一前体或活性前体(如酰基辅酶A单位)为反应单位的重复寡聚化反应;(3)在根途径或中间代谢分枝途径中,前体经不同修饰生成的中间物为单位的缩合反应;(4)大量修饰作用如氧化还原、基因转移、水解作用或同分异构化等的存在;(5)大部分放线菌次级代谢产物的专一性耗能输出系统;(6)调节物对代谢途径基因表达的专一性调控。上述性质构成了代谢工程的基本特征。

2　代谢途径中酶的演化

次级代谢中参与生物合成的功能特异性酶大多是从一般的前体酶或蛋白质的功能区域演化而来。进化过程中,酶蛋白的子代组成了大的酶家族。这可能是通过基因的聚合形成特殊的功能簇,也可能由多功能酶蛋白的结构域融合而成(如 型多聚链合成酶)[5];或经单亚基或小分子的功能蛋白融合而成。(如 型多聚链合成酶或氨基酸转移酶)。

放线菌中62脱氧己糖(62DOH)及其衍生物的合成是酶修饰作用多样性的一个典型例子。62DOH是构成各种次级代谢产物的基本单位,一般由活化核苷二磷酸己糖(D2葡萄糖或D2甘露糖)生成42酮基262脱氧中间物,然后在NAD依赖的ND P2己糖24,62脱水酶催化下生成。通过在己糖不同位置上的异构化、还原、转氨、甲基化、脱水、C2C键断裂以及乙酰化等修饰作用可形成种类繁多的衍生物,其中超过七十种是在已知的放线菌代谢物中单独发生反应的[6]。若是在己糖链的2,3或4位上进行修饰,将生成D26DOH;若脱水后被3,52差向异构酶催化,则终产物将是L26DOH中的一种。产生D26DOH和L26DOH的路径可同时存在于同一菌株中,并产生相同的终产物。

从蛋白质的相似性来看,所有的ND P2己糖合成酶与其它代谢合成酶类构成酶家族,其中如dTD P2葡萄糖合成酶、CD P2葡萄糖合成酶[7]和GD P2甘露糖合成酶,属于ND P2己糖合成酶;大肠杆菌中的UD P2N2乙酰氨基葡萄糖合成酶[8]及大肠杆菌和小麦中的AD P2葡萄糖合成酶则属于中间代谢合成酶[9,10]。在沙门氏菌属中编码脂多糖O2链的rf b基因簇附近,功能未知的第四ND P2己糖合成酶是由编码胞外肠道多糖cp s2相关基因簇中的rf b2OR F218基因编码的[10]。目前已有证据表明放线菌只利用dTD P2葡萄糖途径合成6DOH[6]。

在62DOH合成和其它糖修饰过程中,一组结构功能相关的酶都属于UD P2葡萄糖42异构酶(GalE)酶家族[11],它包括ND P2葡萄糖4, 62脱水酶(StrE、Lm b M、R fb、R fbG和R ffE)、dTD P双氢链霉糖合成酶(Str L)、dTD P2L2鼠李糖合成酶(R fbD)、CD P2阿可比糖合成酶(R fbJ)、CD P2泊雷糖合成酶(R fbS)、CD P2泰威糖22差向异构酶(R fbE)以及迄今功能未知的酶。StrP可能参与了链霉素生物合成途径中[12]形成ND P2(N2甲基)2L2葡萄糖胺中间物的氧化还原反应,其功能可能是催化42差向异构化。

氨基转移酶2脱水酶家族也是一个功能多样性的酶家族,它包括StrS、Sts A、StsC、Lm bS 和R fbH蛋白,这个酶家族在肽链的主要结构上是同源的,并在典型的次级代谢途径中广泛存在。最初认为这些基因产物是多效的调节物(如基因簇或其亚组表达的活化物),近来的研究结果有力地证明了这个蛋白家族的成员是次级代谢途径中的生物合成酶[13],因为:(1)这个酶家族的成员之一A scC酶与R fbH非常相似(蛋白质顺序85%相似),前者的功能是将吡哆胺磷酸转移到CD P242酮262脱氧葡萄糖分子上[14];(2)StrS类的蛋白质并非调节物,而是与天冬氨酸氨基转移酶相似[12];(3) A m y cola top sis m ed iterranei中纯化的A HBA S (42氨基52羟基酪酸盐合成酶)表现出吡哆醛的紫外光谱。氨基转移酶亚组的成员在蛋白质序列中保留了一个赖氨酸残基,这在其它氨基转移酶中也存在,而脱水酶亚组(A scC和R fbH)在这个位置上为组氨酸残基。此酶家族其它成员不含A csC和R fbH蛋白所具有的七个保守的半胱氨酸残基,其中四个存在于A scC和R fbH的插入肽链上,这两种蛋白质与纯化的