多酚氧化酶

实验五苹果中多酚氧化酶最适温度的测定
一、实验目的
通过对苹果多酚氧化酶最适温度的测定，掌握测定原理，练习实验操作，同时认识温度对酶活力的影响及酶的性质与应用。

二、原理
果蔬中的多酚氧化酶在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。

多酚氧化酶能催化两类不同的反应。

如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。

三、步骤
1、多酚氧化酶粗提液的制备
冷冻的苹果小块100g+400mL预冷至-26℃的丙酮，均质化得均浆，迅速抽滤，保留沉淀，用冷风快速吹去残留的丙酮（至沉淀无丙酮味）。

丙酮粉溶于150mL 0.05mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.5中），在冰浴条件下搅拌30min，冷冻离心（3000rpm，10min），所得上清液即多酚氧化酶粗提液。

2、测定不同温度下苹果中多酚氧化酶的活力
在比色皿中加入2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，在一定温度（40、50℃）下搅拌保温5min，再加入0.3mL在相同温度下保温5min的酶液，立即搅拌并检测反应体系在400nm处吸光值的变化（2min内，每15s读数一次）。

四、数据处理
1、以吸光值为纵坐标，反应时间为横坐标，作出反应曲线，从曲线最初的直线部分的斜率计算出多酚氧化酶的活力，每分钟吸光值增加1定义为一个酶活力单位。

2、比较不同温度下，多酚氧化酶的酶活大小。