植物组织培养实验

2020/4/16
实验三 外植体材料的预处理、 消毒及接种
• 一、实验目的：
熟悉外植体材料的预处理，掌握其消 毒和接种方法。
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二、方法步骤：
（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去 不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来 水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料 清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。
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二、方法步骤：
• （一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水 至需配培养基终体积
• 500 mL的3/4，加热使之溶解，并在80℃ 热水浴中保温。
• （二）分别加入一定量的MS培养基贮备液 I、II、III和IV，然后1~5各小组再分别加入 各自不同量的NAA（0.25；0.5；0.75；1 及1.5 mg）。
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实验五 枝芽增殖培养的外植体的 处理与接种
• 一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培 养外植体的处理、接种方法。
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二、方法步骤：
• （一）将经湿热灭菌装有培养基的培养 容器、接种用具等置于超净台上，打开 超净台的紫外灯，灭菌处理30 min。
• （二）操作人员坐到超净台前，用浸有 70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手 等部分。
• （三）充分混匀后，用0.1 mol/L的NaOH 和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。
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三、作业：
• 在进行根再生诱导培养基设计时，应注意哪些 问题？
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（二）分别加入一定量的MS培养基 贮 备 液 I 、 II 、 III 和 IV 及 NAA 0.25 mg，然后1~5各小组再分别加入各 自 不 同 量 的 BA （ 0.25 ； 0.5 ； 0.75 ；1及1.5 mg）。
（三）充分混匀后，用0.1 mol/L的
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三、作业：
• 在进行枝芽增殖培养基设计时，应 注意哪些问题？
• （三）点燃酒精灯，从装有无菌苗的培 养瓶中取出无菌苗，置于无菌的培养皿 中的无菌滤纸上，用灭过菌的刀和镊子 配合操作，从叶柄处切下，将所有叶片
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三、作业：
• 进行增殖试验结果的观测、比较、记录 和分析。
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实验六 根再生诱导培养基的 设计与配制
一、实验目的：学习、掌握根再生诱导培养基的设计、 配制方法。
贮备液II(mg)
KI 2020/4/16
8.3
贮备液III(mg)
FeSO4 7H2O
Na2 EDTA 2H2O
27 8 100m 37 L 3
生长调节剂
6-BA
50 mg
50mL
NAA
50 mg
50mL
贮备液IV(mg)
肌醇
10
实验二 固体培养基的配制与灭菌
一、实验目的： 学习、掌握植物组织固体培养基的配
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（九） 在完成了该第一只培养容器的外植体接种操 作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌 ，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台 台面的灭菌，直至全部完成。
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三、作业：
• 练习无菌操作；统计植物材料表面灭菌结果； 分析污染原因；提出减少或避免污染的措施。
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实验一 培养基贮备液（母液）的配制
•目的与要求：
熟悉MS培养基的组成，掌握 贮备液的配制方法.
•实验步骤：
称量 定容。
分别溶解
混合
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一，MS培养基的组成
1、大量成分→贮备液I mg/L
NH4NO3 1650
KNO3
CaCl2 2H2O 440
1900
MgSO4 7H2O 370
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（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放 入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并 且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每 100 mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80） 等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料 至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述 灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30 秒。
• （二） 如需配制MS培养基的20×的贮 备液I量为500 mL、100×的贮备液II、III
和IV各100 2020/4/16 mL以及BA和NAA（浓度为1
贮备液I(g)
MgSO47H 3.7
2O
0
NH4NO3 16. 50
CaCl22H2 4.4 500
O
0 mL
KNO3
19.
00
KH2PO4 1.7 0
•配制100倍浓度贮备液100mL.
4 、 有 机 成 分 → 贮 备 液 IV /L 2020/4/1m6 g
二，常用生长调节剂
• 6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏 水定容）。
• NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后
以蒸馏水定容）。
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三、作业：
• （一） 一般可将MS培养基分为哪四个 部分？分别含有几种试剂？各种试剂的 浓度（mg/L）如何？
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2 、 微 量 成 分 → 贮 备 液 II mg/L
KI
0.83
H3BO3
6.2
MnSO4 4H2O
22.3
ZnSO4 7H2O
8.6
Na2MoO•配4 2制H120O0倍浓度贮备液100mL.0.25
CuSO4 5H2O 0.025
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3 、 铁 → 贮 备 液 III mg/L 27F.8eSO4•配7H制21O00倍浓度贮备液100mL. Na2 EDTA 2H2O 37.3
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（七）倒出、沥去最后一次清洗 用水，开始进行植物材料的切割及接种 。
逐一取出经上述灭菌处理的植物材料 ，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（ 或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左 手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切
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（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容 器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒 ，以将其可能带有的微生物等固定于原 处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与 食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手 无名指与最小指之间；再将培养瓶口在 酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指 与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准
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（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促 进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使 灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻 璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸， 注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水， 轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌 时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止 。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。
制和灭菌方法。
二、实验步骤：
称量
混合
调pH值
灭
菌
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•称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量 的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L）， 置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的 3/4左右，（加热）使之溶解。 •混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、 IV和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏 水直至需配培养基的终体积。 •调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH 值至5.8。 •灭菌：封严培养容器口后，120 ℃灭菌20 min 后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下 冷却，备用。
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• （四） 操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上 帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并 将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、 洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精 棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材 料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作 台上操作。
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实验四 枝芽增殖培养基的 设计与配制
一、实验目的： 学习、掌握枝芽增殖培养基的设
计、配制方法。
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二、方法步骤：
（一）称取4 g琼脂和15 g蔗糖，加 蒸馏水至需配培养基终体积500 mL 的 3/4 ， 加 热 使 之 溶 解 ， 并 在 80℃ 热水浴中保温。
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（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100 ml水）等 浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水 。这是进一步减少污染的处理。
同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。
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• （三） 将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从 高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工 作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min 后关掉紫外灯。