生化实验论文

生物化学实验论文

萌发小麦种子中淀粉酶酶学性质研究

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萌发小麦淀粉酶酶学性质的研究Enzymatic properties of the diastase from germinant wheat

东北农业大学生命科学学院

摘要：本实验以萌发的小麦种子为材料，提取得到淀粉酶液，研究温度、pH、激活剂及抑制剂对淀粉酶的活性的影响，并测定萌发小麦种子不同位置α淀粉酶和总酶活力。不同的温度、PH条件下和加激活剂或抑制剂情况下淀粉酶将淀粉水解的程度不同，产物遇碘呈现不同的颜色，由此可知道酶活性的最适温度和最适PH。同时激活剂可以增强酶活性和抑制剂可以抑制酶活性。由实验可知低温抑制酶活性，高温使酶失活，40℃是小麦淀粉酶的最适温度；酶的催化活性受pH极为显著，酶在最适PH值时，表现活性最高，高于或低于最适pH值时，活性逐渐较低。对于淀粉酶，酸性失活、碱性抑制，最适pH=5.6；氯离子是小麦淀粉酶的激活剂，铜离子是小麦淀粉酶的抑制剂。对酶的活力进行测定时，麦芽糖能将3、5—二硝基水杨酸还原成棕红色的氨基化合物（520nm处有最大吸收峰），其颜色深浅与麦芽糖浓度成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，从而得到单位质量样品一定时间生成的麦芽糖的量来表示酶活力。

关键词：酶活性淀粉酶温度 pH值激活剂抑制剂

酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH 和离子强度下才具有生物活性。酶是生物体系中的催化剂，生物体内的各种化学反应包括物质转化和能量转化，都是在特定的酶催化下反应的，由于自然界中生物长期进化和组织功能分化的结果，酶在机体中受到严格的调控，使错综复杂的代谢过程有序进行。可以说，没有酶的参与，生命活动即告终止。

淀粉主要存在于植物中，是植物中最主要的储存多糖，尤其是在萌发后的禾谷类种子籽粒中淀粉酶活性更强。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖，麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可以从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。α-淀粉酶是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一，目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖，等多种行业。

本实验仅限于酶学研究的最基本的理论和实验技能。通过此次实验研究，让我们进一步加深对淀粉酶的认识和学习，同时培养我们设计实验的基本思路，学会科学的实验组合，提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据,也为我们以后更多的设计型实验作好铺垫。

1.材料与方法

1.1材料：小麦（Triticum aestivum L.）由东北农业大学生命科学学院生化教研室提供）

1.2方法

1.2.1淀粉酶粗酶液的提取

称取1g萌发的小麦种子置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入刻度试管中定容至25mL，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入一个干净试管中，即为淀粉酶粗酶液.

1.2.2温度对淀粉酶的活性的影响

准备8支试管分别编号A、a、B、b、C、c、D、d。在A、B、C、D中分别加入pH=5.6的缓冲液1mL,然后分别加入2.5mL淀粉溶液。在a、b、c、d中分别加淀粉酶提取液1mL。将A、a放在4℃的环境下预保温10min；将B、b放在室温的环境下预保温10min；将C、c 放在40℃的环境下预保温10min；将D、d放在沸水浴的环境下预保温10min。然后将A倒入到a中，将B倒入到b中，将C倒入到c中，将D倒入到d中,混匀。将a、b、c、d分别放在4℃、室温、40℃、沸水浴10min。最后在各试管中加入碘液各三滴，并记录观察到的颜色。

1.2.3 pH对淀粉酶的活性的影响

准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，在试管Ⅰ中加入PH为3.0的缓冲液2ml。同理在试管Ⅱ中加入pH为5.6、试管Ⅲ中PH为8.0的缓冲液2mL。然后再各加入淀粉溶液2.5mL，淀粉酶提取液1mL。摇匀,40℃水浴10min。最后各加碘液3滴，将并记录观察到的颜色。1.2.4激活剂与抑制剂对淀粉酶的活性的影响

准备三支试管分别编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，首先各加缓冲液（pH5.6）2mL。然后在Ⅰ中加NaCl

溶液1mL,Ⅱ中加CuSO4溶液1mL,Ⅲ中加水1mL。在三个试管中各加2.5mL淀粉溶液及1mL 淀粉提取液，摇匀,40℃水浴10min。最后各加碘液3滴，并记录观察到的颜色。

1.2.5 小麦种子中α-淀粉酶活力的测定

分别称取2g萌发的小麦种子根、芽、麦粒，置于研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入离心管，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入25mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶原液。（用于α-淀粉酶活力的测定）

准备4支干净的试管。分别编号为0、1、2、3。分别向1、2、3、号管中加入淀粉酶原液1mL，然后将各试管和淀粉溶液置于70℃水浴中15min，取出后冷却，再将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min，然后分别在1、2、3号管中加入pH=5.6的柠檬酸铵缓冲液1mL，向1管中加入氢氧化钠4mL,分别向1、2、3号管中加入淀粉溶液2.0mL，0号管内加入蒸馏水2mL作为空白组，在40℃水浴中进行准确保温5min;最后在2、3号管中加入氢氧化钠各4mL(终止酶促反应)。

将各试管摇匀，分别取1mL,放入25mL刻度试管中，再加入2mLDNS试剂混匀，置于沸水浴中煮沸5min,取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL混匀，在分光光度计为540nm处进行比色，测定光密度值，记录测定结果。

按照以上步骤分别测定小麦芽和跟试验过后的光密度值，记录测定结果。

1.2.7小麦种子中总淀粉酶总活力的测定

分别称取2g萌发的小麦种子根、芽、种子，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水研磨匀浆，将匀浆倒入离心管，提取液在室温下静置提取15~20min每隔数分钟搅动一次，使其充分提取，然后在4000rp/min转速下离心10min，将上清液倒入25mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶原液。（用于α-淀粉酶活力的测定）吸取上述淀粉酶原液1mL，放入2mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。（用于淀粉酶总活力的测定）

准备4支干净的试管。分别编号为0、1、2、3。分别向1、2、3、号管中加入淀粉酶稀释液1mL，然后将各试管和淀粉溶液置于40℃水浴中保温10min，分别在1、2、3号管中加入pH=5.6的柠檬酸铵缓冲液1mL，向1管中加入氢氧化钠4mL,分别向1、2、3号管中加入淀粉溶液2.0mL，0号管内加入蒸馏水2mL作为空白组，在40℃水浴中进行准确保温5min;最后在2、3号管中加入氢氧化钠各4mL(终止酶促反应)。