免疫球蛋白G_IgG_三种提取方法比较_刘生杰

出每一个方法的总时间（不含透析时间），从而对其时 效性进行比较。
１．８ 经济性比较 分别计算 ３ 种方法所用药品价钱的总和，除以所
用血清的量，来比较其经济性效益，所得结果越小，其 经济效益越好。
·４０·
管号 ＢＳＡ／μｌ ＰＢＳ／μｌ 考马斯亮蓝溶液 ／ｍｌ 总量 ／ｍｌ ＢＳＡ 浓度 ／（ｍｇ．ｍｌ－１） ＢＳＡ 吸光度值
总量 ／ｍｌ
血清 １：６４
５０
１００
２．８５
３．００
辛酸沉淀上清 １：５
５０
１００
２．８５
３．００
硫酸氨沉淀 ＰＢＳ 稀释液 １：２０
５０
１００
２．８５
３．００
辛酸 － 硫酸氨沉淀 ＰＢＳ 稀释液 １：１０
５０
１００２．８５３．００１．７ 粗提时效性比较 分别统计 ３ 种方法每一步骤所需时间，最后计算
１３０
１２０
１１０
１００
９０
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
２．８５
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
３．００
０
０．００３３３４
０．００６６６７
０．０１
０．０１３３３４
畜牧兽医科学
中国农学通报 第 ２３ 卷 第 １１ 期 ２００７ 年 １１ 月 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
· ３９ ·
值巨大。但有效利用 ＩｇＧ 的关键是缺乏快速高效的提 取技术，由于血清蛋白种类多，目前还没有技术能实现一 步 提 取 纯 化 ，须 多 种 方 法 结 合 方 能 奏 效 ［１］，但 粗 提 的 效果却制约着纯化的得率和纯度。从血液中提取免疫 球蛋白，常用的方法有盐析法（如多聚磷酸钠絮凝法， 硫酸氨盐析法）、有机溶剂沉淀法（如冷乙醇分离法、 辛酸沉淀法）、有机聚合物沉淀法、变性沉淀法、纤维 素层析法、凝胶层析法、超滤法等，许多学者对提取免 疫球蛋白作过一些深入的研究［２］，但对抗体纯化的综 合方法比较的较多，而限制纯化纯度和得率的瓶颈阶 段— ——粗提阶段则比较研究较少，尤其是以大量提取 免疫球蛋白为目的的比较研究较少，笔者比较了辛酸 沉淀法、硫酸铵分步盐析法和辛酸 － 硫酸铵盐析法 ３ 种常用提取 ＩｇＧ 方法的效果，以期为猪血清免疫球蛋 白的快速、经济、大量提取和综合利用提供参考。 １ 材料与方法 １．１ 材料
在动物免疫系统中，免疫球蛋白 Ｇ （Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ＩｇＧ）含量最高，是体液免疫的主力军，占血清中免 疫球蛋白总量的 ７５％，以单体形式存在，有两种结构 型，分子量约为 １６０ＫＤ。ＩｇＧ 因具有多种生物学活性被 广泛用于医学临床、免疫学实验、抗血清与单抗制备、
食品与饲料工业等。猪血中也含有大量 ＩｇＧ，如果能把 这些抗体提取和纯化，能有效地治疗各种传染病，同时 也能对猪血加以综合利用；中国又是猪的生产大国，猪 血的产量很大，但应用却非常有限，主要用作饲料或当 作废物而浪费，所以猪血清 ＩｇＧ 的应用潜力和经济价
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ． １１ ２００７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
畜牧兽医科学
表 ２ ＢＳ Ａ（ 牛血清白蛋白） 标准液配制与吸光度值纪录
０
１
２
３
４
５
６
０
１０
２０
３０
４０
５０
６０
１５０
１４０
·３８·
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｖｏｌ．２３ Ｎｏ． １１ ２００７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｓｂ．ｏｒｇ．ｃｎ
畜牧兽医科学
免疫球蛋白 Ｇ（ＩｇＧ）三种提取方法比较
刘生杰 １，２， 朱茂英 ２， 顾士彬 ２， 唐 梅 ２， 周 扬 ２， 余为一 １ （１ 安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 ２３１０７２；２ 阜阳师范学院生命科学学院，安徽阜阳 ２３６０４１）
摘 要： 比较 ３ 种提取猪血清中免疫球蛋白 ＩｇＧ 方法的提取效果。分别用辛酸沉淀法， 硫酸铵分步沉淀 法， 辛酸－ 硫酸铵沉淀法粗提猪血清免疫球蛋白 ＩｇＧ， 并通过 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 凝胶电泳、ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ 凝胶 成像分析软件、Ｂｒａｄｆｏｒｄ 蛋白浓度测定法等比较 ３ 种方法的提取纯度和得率， 同时比较 ３ 种方法的时效 性和经济性。辛酸沉淀法提取 ＩｇＧ 所用时间最短， 只需 １ｈ， 得率较高但纯度不高； 硫酸铵盐析法提取的 ＩｇＧ 纯度较高、得率也高， 但时间较长； 辛酸－ 硫酸铵分步沉淀法所得 ＩｇＧ 纯度很高， 但所用时间较长， 得率也较低。３ 种提取方法各有特点， 可根据不同的实验条件和目的选择不同的提取方法。 关键词： 猪血清； 免疫球蛋白； 提取方法； 比较 中图分类号： Ｑ８１；Ｓ８５ 文献标识码： Ａ
新鲜猪血液于 ２００７ 年 ３ 月采自阜阳市颖南屠宰 厂，血清由常规制备。 １．２ 硫酸铵分步盐析法（ ５０％－ ３３％－ ３３％分步盐析法）
按文献［３］方法作适当改进提取 ＩｇＧ。取 ２０ｍｌ 血清 加入 ２０ｍｌ ＰＢＳ，磁力搅拌下缓慢滴加 ４０ｍｌ 饱和硫酸 铵至硫酸铵终浓度 ５０％，调 ｐＨ７．０，４ ℃搅拌 ６ｈ 或过 夜后静止 １ｈ，４０００ｒ／ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ，弃上清；沉淀溶于 ４０ｍｌ ＰＢＳ，磁力搅拌下缓慢滴加 ２０ｍｌ 饱和硫酸铵至终 浓度 ３３％，调 ｐＨ７．０，４ ℃搅拌 ６ｈ 后静止 １ｈ，４０００ｒ／ｍｉｎ 离心 ３０ｍｉｎ，弃上清，重复 ３３％硫酸铵沉淀步骤一遍。 终 沉 淀 物 溶 于 ２０ｍｌ ＰＢＳ，４ ℃ 条 件 下 对 ＰＢＳ 透 析 ４８ｈ，至 ＢａＣｌ２ 检测无 ＳＯ４２－ 为止，浓缩后冷冻保存。 １．３ 辛酸沉淀法
采用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 法［６］，电泳采用 ５％浓缩胶、１０％ 分 离 胶 ， 并 以 ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ 凝 胶 成 像 系 统 对 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳图进行图像分析，根据蛋白 Ｍａｒｋｅｒ 测 定待测蛋白分子量，并分别测定 ３ 种提取方法所获得 ＩｇＧ 纯度。 １．６ 蛋白浓度测定及得率比较
Ｃｏｍｐａｒ ｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｈｒ ｅｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｕｒ ｉｆｙｉｎｇ ＩｇＧ ｆｒ ｏｍ Ｓｗｉｎｅ Ｓｅｒ ｕｍ Ｌｉｕ Ｓｈｅｎｇｊｉｅ１，２， Ｚｈｕ Ｍａｏｙｉｎｇ２， Ｇｕ Ｓｈｉｂｉｎ２， Ｔａｎｇ Ｍｅｉ２， Ｚｈｏｕ Ｙａｎｇ２， Ｙｕ Ｗｅｉｙｉ１
（１Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｈｕｉ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ ２３１０７２； ２Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｆｕｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｆｕｙａｎｇ， Ａｎｈｕｉ ２３６０４１）
采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法。分别取 ５０μｌ ３ 种已按一定比例 稀释的粗提蛋白液配制待测样品 （表 １）、ＢＳＡ 标准液 配制（表 ２）均按试剂盒步骤进行。以分光光度计测定 吸光度值，绘制标准曲线并计算待测蛋白浓度。
表 １ 测定样品液配制
样品母液稀释
母液加样量 ／μｌ
ＰＢＳ／μｌ
考马斯亮蓝溶液 ／ｍｌ
按文献［４］方法提取 ＩｇＧ。取 ４ｍｌ 血清，加 １６ｍｌ 乙酸 － 乙酸钠缓冲液稀释，用 ０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ 调 ｐＨ 至 ４．５；
室温下边搅拌边缓慢加入辛酸 ０．５ｍ（ｌ 按辛酸 ２５μｌ／ｍｌ 血清混合液添加），后继续搅拌 ３０ｍｉｎ；１０ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３０ｍｉｎ，弃沉淀，留上清；上清用多层纱布过滤，留滤 液；然后将滤液装入透析袋中透析 ４８ｈ，每 ８￣１０ｈ 换一 次透析液；最后浓缩后冷冻保存。 １．４ 辛酸沉淀－ 硫酸铵分步盐析法
按文献［５］方法改进提取 ＩｇＧ。取 ４ｍｌ 血清，加 １６ｍｌ 乙酸 － 乙酸钠缓冲液稀释，用 ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 调 ｐＨ 至 ４．５；室温下边搅拌边缓慢加入辛酸 ０．５ｍ（ｌ 标准同 １．３），后继续搅拌 ３０ｍｉｎ；１０ ０００ｒｐｍ 离心 ３０ｍｉｎ，弃沉 淀，留上清；上清用多层纱布过滤，留滤液。取 ４ｍｌ ＰＢＳ 加入滤液中，在磁力搅拌下缓慢加入 ２０ｍｌ 饱和硫酸 铵 溶液使浓度 达 ５０％，继续搅 拌 ６ｈ 后静置 １ｈ；用 ４０００ｒ／ｍｉｎ 的转速离心 ３０ｍｉｎ，弃上清，用 ８ｍｌ ＰＢＳ 磷 酸缓冲液溶解沉淀；量取 ４ｍｌ 饱和硫酸铵溶液，磁力 搅拌下缓慢滴加于溶解液中至硫酸铵终浓度 ３３％，调 ｐＨ 至 ７．０， 继 续 搅 拌 ６ｈ 静 置 １ｈ；４０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ３０ｍｉｎ，弃上清，留沉淀；重复 ３３％硫酸铵沉淀步骤一 遍。终沉淀溶于 ４ｍｌ ＰＢＳ 中，然后装入透析袋中透析 ４８ｈ，每 ８￣１０ｈ 换一次透析液，至检测无 ＳＯ４２－ 为止；最 后浓缩后冷冻保存。 １．５ 蛋白质分子量和纯度鉴定
基金项目： 安徽省教育厅自然科学基金项目“对皖北近年夏季流行猪持续性高热传染病病原体分离鉴定与防治研究”（２００４ｋｊ３０７）；国家自然基金项 目“恒定链的点突变对融合基因的表达、定位及其免疫应答的影响”（３０６７１５３７）资助。 第一作者简介： 刘生杰，男，１９７１ 年出生，安徽阜阳人，硕士，讲师，兽医师，主要从事动物免疫学教学科研及兽医临床工作。通信地址：２３６０４１ 安徽阜 阳市清河东路 ７４１ 号 阜阳师范学院生命科学学院；Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｓｊ９６９９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。 通讯作者： 余为一，男，１９５２ 年出生，博士，教授，主要从事预防兽医学研究。通信地址：２３１０７２ 安徽省合肥市长江西路 １３０ 号 安徽农业大学科技处。 Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｗｅｉｙｉ＠ａｈａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。 收稿日期： ２００７－０９－１０，修回日期：２００７－０９－２４。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒｏｍ ｓｗｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅｉｒ ｐｕ－ ｒｉｆｙｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ． Ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｙ－ ｓｔｅｐ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｏｃ－ ｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ－ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ＩｇＧ ｆｒｏｍ ｓｗｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ， Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｋｉｔ ａｎｄ ＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ＩｇＧ， ｔｈｅ ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｎｅｅｄｓ ｓｈｏｒｔｅｓｔ ｔｉｍｅ， ｏｎｌｙ １ ｈｏｕｒ． Ｂｕｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｉｓ ｌｏｗｅｓｔ ，ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｉｓ ｈｉｇｈ ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｂｙ ａｍｍｏｎｉ－ ｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｙ－ ｓｔｅｐ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｒｅ ｈｉｇｈｅｒ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｉｓ ｌｏｎｇｅｒ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ－ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｇａｉｎｓ ｔｈｅ ｐｕｒｅｓｔ ＩｇＧ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｉｓ ｌｏｎｇｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｉｓ ｌｏｗ－ ｅｓｔ． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ ｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ， ｔｈｅｙ ｃａｎ ｂｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｄｉ－ ｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｓｗｉｎｅ ｓｅｒｕｍ， ＩｇＧ， ｐｕｒｉｆｙ， ｃｏｍｐａｒｅ