弓形虫病血清学诊断技术

弓形虫病血清学诊断技术

一、实验目的及要求

掌握弓形虫病血清学诊断技术，通过对弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。

二、实验器材

弓形虫虫株、小白鼠、恒温箱、离心机、血清、G3砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型V反应板、微量加样器、无菌试管、一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、ELISA 板、等。

药品：生理盐水、胰酶、美蓝染液、PBS、弓形虫诊断制剂（IHA抗原）、碘酒、70%酒精、无菌生理盐水、5%柠檬酸钠、DAB、Tris盐酸、牛血清白蛋白(BSA)等。

三、实验方法步骤和操作要领。

弓形虫病血清学诊断技术主要有以下几种方法：

（一）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）

染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）。是弓形虫特有的血清学诊断法，此法特异性高而且被认为是标准的诊断方法。其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37℃作用1h或室温数小时后，大部分滋养体由原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具有较强的亲和力而被深染。但当弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor.AF)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协同作用而变性，对碱性美蓝不着色。计算着色与不着色虫体比例即可判断结果。

1.辅助因子。存在于正常人新鲜血清内，不耐热。用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血清与弓形虫速殖子混合，37℃作用1h后，有90％以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子（AF）。含辅助因子血清可分装后于一2O℃保存备用。

2.抗原制备。弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次 (300Or/min×lOmin)，收集纯净虫体。也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经G3砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获虫体用辅助因子血清稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。

3.美蓝染液。美蓝10g加入95％乙醇溶液1OOml，滤纸过滤，取3ml加pHll的碱性缓冲液（O.53％Na2CO39.73ml，1.91％Na2B4O70.27ml）lOml。碱性缓冲液临用前配制。

4.待检血清。新鲜血清需经56℃30min灭活，或直接用生理盐水倍比稀释后，每管0.lm1,4℃中次日使用。

5.检测。在稀释血清内每管加上述抗原悬液0.lml，37℃孵育1h，滴加美蓝染液0.O2ml/管，继续温育l5min后，自每管取悬液1滴涂片，加盖玻片镜检。

6.结果判定。计算各管不着色虫体的百分比，以50％虫体不着色管的血清稀释度为该份被检血清的最高抗体滴度。一般认为，抗体滴度1:8为隐性感染;1:956为活动性感染;1:1024以上为急性感染。

DT所测抗体是虫体表膜抗原诱导的特异性抗体。本试验易与肉孢子虫抗血清发生交叉反应；操作中需用活虫；辅助因子血清筛选较烦琐。

（二）荧光抗体试验（FA）

荧光抗体试验（FA）该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了生物学上的许多难题。其原理是：用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

1.直接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。取被检动物腹股沟淋巴结压印片，冷丙酮4℃固定10min。

②洗涤。将固定好的压印片用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

（2）直接染色。

①在压印片上滴加用0.01mol/LpH值8.0PBS稀释的1：16的荧光标记的特异抗体。

②放于湿盒内，37℃经30min孵育。

③用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

④用0.01%伊文思兰液复染，在滴加后立即洗去，并吹干。

⑤载玻片上加缓冲甘油并覆以盖玻片封片。

⑥置荧光显微镜下立即观察。

⑦结果判定标准：+ + + + 黄绿色闪光荧光

+ + + 黄绿色亮荧光

+ + 黄绿色荧光较弱

+ 仅有暗淡的荧光

- 无荧光

2.间接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。将冰冻的被检动物腹股沟淋巴结进行切片，冰冻切片置载玻片上，以—30℃丙酮4℃固定30min。

②洗涤。将固定好的切片以PBS漂洗，漂洗5次，每次3min。

（2）间接染色。

①一抗作用。在晾干的标本片上滴加弓形虫抗体，置湿盒，37℃作用30min。

②洗涤。以吸管吸取PBS冲洗标本片上的弓形虫抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

③二抗染色。滴加荧光抗体，置湿盒，37℃染色30min。

④洗涤。以吸管吸取PBS冲洗标本片上的荧光抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

⑤晾干。将标本片置晾片架上晾干。

⑥镜检。将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。

本试验应设以下对照：①自发荧光对照。②已知阳性对照。③已知阴性对照。

结果判定。同上。

（三）间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)

间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)亦称被动血凝试验，其操作简单、价格低廉、敏感性高、特异性强，宜作为辅助诊断、流行病学调查的方法。反应原理是：将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。

（1）弓形虫抗原的制备。取小鼠，以碘酒和70%酒精消毒小鼠腹部皮肤，腹腔接种弓形虫速殖子，4d后乙醚麻醉或颈椎脱臼法处死小鼠，以碘酒和70%酒精消毒腹部皮肤，向腹腔内注入无菌生理盐水3～4m1，轻揉腹壁，再抽取腹腔液，2500rpm离心15min,倾去上清液，在沉淀中加10倍pH 7.2 PBS，振荡混匀，4℃过夜，10000rpm4℃离心1h，取上清液加等量1.7%盐水。—20℃以下保存备用。

（2）绵羊红细胞的鞣化。