弓形虫病血清学诊断技术

弓形虫病血清学诊断技术
一、实验目的及要求
掌握弓形虫病血清学诊断技术，通过对弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。

二、实验器材
弓形虫虫株、小白鼠、恒温箱、离心机、血清、G3砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型V反应板、微量加样器、无菌试管、一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、ELISA 板、等。

药品：生理盐水、胰酶、美蓝染液、PBS、弓形虫诊断制剂（IHA抗原）、碘酒、70%酒精、无菌生理盐水、5%柠檬酸钠、DAB、Tris盐酸、牛血清白蛋白(BSA)等。

三、实验方法步骤和操作要领。

弓形虫病血清学诊断技术主要有以下几种方法：
（一）染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）
染色试验（Sabin—Feldman dye tese，DT）。

是弓形虫特有的血清学诊断法，此法特异性高而且被认为是标准的诊断方法。

其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37℃作用1h或室温数小时后，大部分滋养体由原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具有较强的亲和力而被深染。

但当弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor.AF)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协同作用而变性，对碱性美蓝不着色。

计算着色与不着色虫体比例即可判断结果。

1.辅助因子。

存在于正常人新鲜血清内，不耐热。

用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血清与弓形虫速殖子混合，37℃作用1h后，有90％以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子（AF）。

含辅助因子血清可分装后于一2O℃保存备用。

2.抗原制备。

弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次 (300Or/min×lOmin)，收集纯净虫体。

也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经G3砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获虫体用辅助因子血清稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。

3.美蓝染液。

美蓝10g加入95％乙醇溶液1OOml，滤纸过滤，取3ml加pHll的碱性缓冲液（O.53％Na2CO39.73ml，1.91％Na2B4O70.27ml）lOml。

碱性缓冲液临用前配制。

4.待检血清。

新鲜血清需经56℃30min灭活，或直接用生理盐水倍比稀释后，每管0.lm1,4℃中次日使用。

5.检测。

在稀释血清内每管加上述抗原悬液0.lml，37℃孵育1h，滴加美蓝染液0.O2ml/管，继续温育l5min后，自每管取悬液1滴涂片，加盖玻片镜检。

6.结果判定。

计算各管不着色虫体的百分比，以50％虫体不着色管的血清稀释度为该份被检血清的最高抗体滴度。

一般认为，抗体滴度1:8为隐性感染;1:956为活动性感染;1:1024以上为急性感染。

DT所测抗体是虫体表膜抗原诱导的特异性抗体。

本试验易与肉孢子虫抗血清发生交叉反应；操作中需用活虫；辅助因子血清筛选较烦琐。

（二）荧光抗体试验（FA）
荧光抗体试验（FA）该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了生物学上的许多难题。

其原理是：用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。

1.直接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。

取被检动物腹股沟淋巴结压印片，冷丙酮4℃固定10min。

②洗涤。

将固定好的压印片用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

（2）直接染色。

①在压印片上滴加用0.01mol/LpH值8.0PBS稀释的1：16的荧光标记的特异抗体。

②放于湿盒内，37℃经30min孵育。

③用0.01mol/LpH值7.2～7.4PBS漂洗，漂洗5次，每次3min，吹干。

④用0.01%伊文思兰液复染，在滴加后立即洗去，并吹干。

⑤载玻片上加缓冲甘油并覆以盖玻片封片。

⑥置荧光显微镜下立即观察。

⑦结果判定标准：+ + + + 黄绿色闪光荧光
+ + + 黄绿色亮荧光
+ + 黄绿色荧光较弱
+ 仅有暗淡的荧光
- 无荧光
2.间接荧光抗体试验。

（1）标本制备。

①切片制备。

将冰冻的被检动物腹股沟淋巴结进行切片，冰冻切片置载玻片上，以—30℃丙酮4℃固定30min。

②洗涤。

将固定好的切片以PBS漂洗，漂洗5次，每次3min。

（2）间接染色。

①一抗作用。

在晾干的标本片上滴加弓形虫抗体，置湿盒，37℃作用30min。

②洗涤。

以吸管吸取PBS冲洗标本片上的弓形虫抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

③二抗染色。

滴加荧光抗体，置湿盒，37℃染色30min。

④洗涤。

以吸管吸取PBS冲洗标本片上的荧光抗体，后置大量PBS中漂洗，共漂洗5次，每次3min。

⑤晾干。

将标本片置晾片架上晾干。

⑥镜检。

将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。

以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。

本试验应设以下对照：①自发荧光对照。

②已知阳性对照。

③已知阴性对照。

结果判定。

同上。

（三）间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)
间接血凝试验（IHA）(indirecthaemagglutinationtest,IHAAT)亦称被动血凝试验，其操作简单、价格低廉、敏感性高、特异性强，宜作为辅助诊断、流行病学调查的方法。

反应原理是：将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。

（1）弓形虫抗原的制备。

取小鼠，以碘酒和70%酒精消毒小鼠腹部皮肤，腹腔接种弓形虫速殖子，4d后乙醚麻醉或颈椎脱臼法处死小鼠，以碘酒和70%酒精消毒腹部皮肤，向腹腔内注入无菌生理盐水3～4m1，轻揉腹壁，再抽取腹腔液，2500rpm离心15min,倾去上清液，在沉淀中加10倍pH 7.2 PBS，振荡混匀，4℃过夜，10000rpm4℃离心1h，取上清液加等量1.7%盐水。

—20℃以下保存备用。

（2）绵羊红细胞的鞣化。

①绵羊红细胞的采集和处理。

以碘酒和70%酒精消毒健康绵羊颈部皮肤，用5m1的一次性灭菌注射器采集全血2～3m1，快速注入含有0.2～0.3 ml 5%柠檬酸钠的试管内，轻轻摇匀。

2000rpm离心l 0min，加入0.15M pH 7.2 PBS适量进行洗涤，2000rpm离心10min，再加入0.15M pH 7.2 PBS适量进行洗涤。

如此反复洗涤3次，用PBS配成2.5%的红细胞悬液。

②绵羊红细胞的鞣化。

在2.5%的红细胞悬液中加入含1%鞣酸的PBS使鞣酸的终浓度为1/10000或1/20000, 3 7℃水浴15min，用PBS洗涤3次，再加PBS配成2.5%鞣化红细胞。

（3）抗原致敏鞣化的绵羊红细胞。

将2.5%鞣化红细胞1份，抗原液1份，pH6.4的PBS液4份混合，摇匀后室温下放置15min，加1%正常兔血清后，2000rpm离心洗涤2次，再用PBS配成2.5%的红细胞悬液。

4℃下保存备存。

（4）待检血清的采集与处理。

取待检血清0.5ml置于试管中，加入1%正常兔血清1.5m.1，56℃灭活30min，加入未致敏的绵羊红细胞2m1，4℃过夜。

（5）间接红细胞凝集试验的操作步骤。

取处理后的待检血清作倍比稀释，于96孔“V”型反应板中每孔加入上述倍比稀释的待检血清50μl，然后加入致敏的绵羊红细胞悬液50μl，37℃作用2h以上，观察结果。

以1：64的稀释度出现50%凝集者判为阳性。

同时设立阳性对照和阴性对照。

（6）结果判定。

①红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，判为“++++”。

②红细胞呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，判为“+++”。

③红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，判为“++”。

④红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，判为“+”。

⑤红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，判为“一”。

⑥结果判定：以出现“一”孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价。

小于或等于1: 16判为阴性;1: 32判为可疑;等于或大于l: 64判为阳性。

兔血清要事先用绵羊红细胞吸收其非特异性凝集素；抗原致敏鞣化的绵羊红细胞，在六个月内有效。

（四）胶乳凝集试验（LA）
胶乳凝集试验（LA）其原理是在特定条件下将寄生虫抗原与胶乳相连接，使成为颗粒型抗原。

这种抗原与寄生虫感染者血清中特异性抗体结合后，即形成抗原-抗体复合物，在有适当电解质存在的条件下，经过一定时间，胶乳颗粒即凝集在一起，显示肉眼可见的凝集团块，即为阳性反应，否则为阴性反应。

1．弓形虫抗原的制备。

（1）弓形虫腹水的制备。

小鼠是获得弓形虫最为满意的动物模型。

小鼠一般在感染速殖子后的4d左右因发病而死亡，此时速殖子大量繁殖并散在于腹腔液中，在其病死前处死，先注入1ml灭菌生理盐水，吸出腹腔液，再用生理盐水洗涤1～2次（有出血者弃去），这样可获得大量的速殖子。

一般认为感染后3d内收集腹水最为适宜，此时白细胞数较少，容易纯化。

（2）速殖子纯化方法。

①胰蛋白酶消化法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入20倍量体积0.25%的胰蛋白酶消化液，37℃消化30min, PBS离心、洗涤3次，沉淀再重复消化洗涤1次，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

②微孔滤膜过滤法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入适量PBS，制成虫体悬液，将此悬液加入装有直径为3µm微孔滤膜的滤器，收集滤液，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

③植物血凝素(PHA-P)法。

将小鼠腹水3000rpm离心5min，弃上清，加入适量PBS，制成虫体悬液，然后加入植物血凝素，使植物血凝素的终浓度为0.005%。

室温下放置30 min。

尼龙纱布过滤，取滤液置于白细胞计数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。

选择虫体回收率、白细胞清除率高以及非特异性可溶性蛋白少的纯化方法作为抗原纯化方法。

（3）弓形虫抗原的制备。

取纯净的弓形虫速殖子，加灭菌双蒸水，混匀，经超声波粉碎或反复冻融5次，经10000rpm离心30min，取上清液加等量1.7%NaCl溶液即为可溶性抗原。

2.胶乳及胶乳抗原制备。

（1）羧化聚苯乙烯胶乳及其衍生物的制备。

①羧化聚苯乙烯胶乳制备。

在苯乙烯的乳液聚合过程中加入丙烯酸单体，可获得带有羧基的聚苯乙烯胶乳。

各组分的重量比为:水/苯乙烯/丙烯酸=180/20/0.9，引发剂为过硫酸钾，乳化剂为10～14烷基苯基磺酸钠。

应用上述方法所制备的羧化胶乳的浓度约0.5%,它的直径为0.5～0.6µm，为较适宜的胶乳颗粒大小。

②羧化聚苯乙烯衍生物制备。

为提高胶乳颗粒结合蛋白分子的反应能力，可通过碳化二亚胺反应，将ε—氨基己酸与胶乳相连接，即为羧化聚苯乙烯衍生物。

③胶乳抗原制备。

通过碳化二亚胺反应，将弓形虫抗原的氨基与羧化聚苯乙烯胶乳衍生物的末端羧基相连接。

交联时，抗原浓度为0.3mg/ml，室温反应2h。

离心洗涤后，悬浮于含0.1%叠氮钠的0.O5mol/L pH7.6磷酸缓冲液中，即为胶乳抗原。

它的胶乳浓度为lOmg/ml。

这种颗粒型抗原保存于4～6℃中，备用。

（2）重氮胶乳抗原制备。

先将5%氨基聚苯乙烯胶乳重氮化，然后使重氮胶乳在酸性条件下，加入等容积抗原。

置37℃缓慢搅拌lOh，以800O×g离心lO min，去上清液。

抗原容积1/2加入20%间苯二酚(0.2moI/ L pH8.3GBS)，混合后，静置2h，用上述GBS以800O×g离心lO min，共3次，最后使成2%胶乳抗原，并加硫柳汞防腐，保存于4℃，备用。

临用前加等容积pH7.4PBS，使成1%浓度，用于检测。

3.操作方法。

吸取已用生理盐水作1：10稀释的待检血清约5Oµl，置胶乳试验玻璃板上，加入胶乳抗原约50µl，轻轻摇动，使其充分混匀，5min后观察反应结果。

每次检测时，均用阴性和阳性参考血清作对照。

凡LA阳性者的血清，应进一步作倍比稀释，以确定其抗体滴度。

4.反应标准。

阳性反应：呈现清晰的凝集颗粒；阴性反应：不呈现凝集颗粒。

胶乳抗原保存于4℃中，避免冰冻，有效期可达一年；试验时，将反应板摇动后，若发现待测样本相互弥混者，需重做；观察反应结果时，应在光亮处进行。

（五）放射免疫试验（RIA）
放射免疫试验（RIA）是将放射性同位素检测的高灵敏度与抗原抗体反应的高特异性相结合的一种免疫标记测定技术。

其原理是待检标本中某微量抗原与用放射性同位素标记的该种抗原（Ag*）竞争结合有限量的特异性抗体，并形成抗原抗体的可溶性复合物Ag-Ab和Ag*－Ab，直至达到平衡状态。

1.加样。

先将各浓度标准品和待检动物标本分别加在小试管中，再顺序加入标记抗原和特异性抗体，保温作用一定时间，让其充分竞争结合。

2.加分离剂。

分离剂实际上是一种沉淀剂（目的是将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开）。

常用的分离剂有抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）、聚乙二醇、硫酸铵、含SPA的金黄色葡萄球、活性炭等。

离心沉淀。

3.测定放射性强度。

分别测定上清液和沉淀物中的放射活性（用液体闪烁计数仪），可得到F和B 值，计算结合率。

4.绘制标准曲线。

以标准品浓度为横座标，与之相应的结合率或B／F值为纵座标绘制标准曲线．以测定管的放射性强度测得值（仍是B/B＋F或B／F），在标准曲线上查出相应的待测抗原的含量。

放射免疫测定（RIA）所用试剂均由专业单位制成成套试剂盒供应，根据检测对象选用相应的试剂盒；试剂盒内一般含有标准品、标记抗原，特异性抗体、分离剂和稀释剂等，可按照说明书上的操作程序进行；具体操作方法因检测项目不同而异。

（六）间接辣根过氧化物酶免疫组化方法
1.病料采集。

采集心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结等组织，置于10%中性福尔马林中固定。

2.石蜡切片的制作。

组织块经过修整、系列酒精脱水、二甲苯透明、透蜡和包埋，制成蜡块，切片厚度4µm 。

3.兔抗弓形虫抗体的制备。

（1）参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。

（2）家兔免疫。

取健康家兔，首次在家兔两后脚足垫部注射0.5m1弗氏完全佐剂进行基础免疫，2周后进行抗原免疫，每只家兔用抗原0.4 m1加等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，在家兔两后脚足垫部注射。

一周后，进行第二次免疫，每只家兔用抗原0.4m1加等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后，在家兔踝淋巴结注射免疫，一周后，进行第三次免疫，操作与第二次免疫相同，免疫一周后，取兔耳静脉血1ml，离心.分离血清，用琼扩试验测定免疫血清效价，若血清效价在1：8以上，最后在兔耳静脉注射0.2m1抗原进行强化免疫，4天后，心脏、颈静脉采血，分离血清。

（3）抗体粗提。

免疫血清加等量pH7.0～7.2的0.01M PBS，滴加饱和硫酸铵溶液至50%浓度，静置3～4h后4000rpm离心15min，倾去上清液，沉淀物加PBS至原血清量，再以33%饱和硫酸铵重复离心3次，每次静置30min，4000rpm离心15min，最后的沉淀物加少量的PBS洗涤，装入透析袋中，袋口严密扎紧，先用自来水流动透析5min左右，再置生理盐水或pH7.4的0.01M PBS中透析72h，透析液的量至少相当于蛋白溶液的100倍以上，期间换透析液3次。

透析情况以1%BaCl2溶液和纳氏试剂检查，要求完全去除硫酸根和铵离子，必要时可通过葡聚糖G50去除。

粗提后血清一20℃保存备用。

4.苏木素一伊红染色(HE染色)。

切片烘烤后，经过二甲苯脱蜡、高浓度酒精到低浓度酒精，回归到水洗，HE染色，中性树胶封片，光学显微镜观察病理组织变化。

5.组织切片辣根过氧化物酶染色方法操作步骤。

采集组织，置于10%福尔马林中固定，梯度酒精脱水(浓度由高到低)，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片4µm，烘片，脱蜡，水洗后4℃保存备用。

用含0.5%过氧化氢甲醇处理30min，0.1%胰蛋白酶消化l 0min，滴加1 %BSA封闭液，37℃湿盒内封闭30min，加兔抗弓形虫抗体，37℃湿盒温育1h，洗涤3次，每次5min，加酶标记二抗，37℃湿盒温育l h，洗涤3次，每次5min，加DAB避光显色反应5～8min，置于蒸馏水浸洗，苏木素衬染，中性树脂封片，光镜下观察结果。

6.结果的判定。

在被检动物的多个组织内观察到被染成棕褐色弓形虫速殖子存在于巨噬细胞或组织细胞中，形成假包囊。

在组织的坏死区内或周围可见散在的游离于组织内被染成棕褐色的单个或成对存在的弓形虫速殖子。

切片经烘片、脱蜡、水洗后置于4℃保存备用；滴加封闭液，置于湿盒内封闭后，只将封闭液甩掉，但不进行洗涤。

（七）间接酶联免疫吸附试验（ELISA）
间接酶联免疫吸附试验（ELISA）可检查抗原、抗体或免疫复合物，操作简单，具有高度特异性和敏感性，且简便经济，结果可定量，适于批量样品的检测。

其原理是已知抗原与酶结合，仍保持其免疫学及生物化学特性，然后与待测样本中的抗体反应，形成酶标记的免疫复合物，如遇相应底物，即产生
颜色反应．颜色深浅与样本中相应抗体的量成正比，故可检测样本内相应抗体的有无及其量的多少。

1.弓形虫抗原的制备。

参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。

2.实验步骤。

（1）包被。

以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释已知抗原（常用5～l0µg/ml）。

每孔100～200µl（包被反应板），37℃湿盒温育2～3h或4℃过夜。

（2）洗涤。

弃去包被液，反应板用0.1M pH7.4PBSTween-20液冲洗3次，每次3 min，甩干。

（3）封闭。

每孔加入100µl封闭液进行封闭，37℃1h，甩去孔底液体，PBST洗涤3次，每次3 min。

（4）加被检动物血清。

用血清稀释液稀释血清（起始浓度＞100-1），每孔100～200µl，37℃孵育1h。

弃去孔底液体，如上冲洗，甩干后加稀释的酶结合物，每孔100（或200）µl，37℃孵育1～2h。

（5）加底物显色。

如上冲洗甩干反应板，即刻加入新配制的底物溶液，每孔100（或200）µl，置暗盒37℃显色20min。

（6）终止反应。

HRP-OPD系统每孔加入2mol/LH2SO450µl。

（7）结果判定。

目测或用酶标检测仪在490nm波长段测定消光值（OD值）。

每块板均设阳性对照、阴性对照各两孔和空白对照一孔，以空白孔调零，490nm波长测定OD值。

如样品OD值/阴性对照值≥2.1，样品OD值一阴性对照值≥0.3，则判为阳性;如样品OD值/阴性对照值<2.1或样品OD值一阴性对照值<0.3，均判为阴性。

（八）ABC— ELISA
ABC— ELISA原理：借助亲和素(avidin)与生物素(biotin)之间极强的亲和力，至少要比抗原和抗体之间的结合高1万倍，且两者结合迅速而稳定，故用于免疫标记技术中，可提高检测的灵敏度，并可缩短反应时间。

在包埋弓形虫抗原的反应板凹孔中，加被检血清后，即形成抗原-抗体复合物，再加生物素标记的羊抗人IgG(Biotin-IgG)，即与复合物相给合，再加ABC复合物(亲和素-生物素-酶结合物)，即与biotin-IgG相结合，最后用相应底物进行显色反应后，用分光光度计测定消光值，即可判读反应结果。

1.弓形虫抗原的制备。

参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。

2.生物素标记羊抗人IgG。

羊抗人IgG血清经50%和33%饱和硫酸铵各盐析一次，收集γ球蛋白部分，透析后测定蛋白质含量。

临用前，以0.1mol/LNaHCO3配成lmg/ml浓度。

将生物素用N-羟基丁二酰亚胺进行酯化反应，使成为酯化生物素，然后用二甲基甲酰胺配成lOmg/ml浓度以每mg抗球蛋白加0.2～0.4mg 酯化生物素的比例，将酯化生物素二甲基甲酰胺溶液加于羊抗人IgG中，震荡混匀lOmin，置于室温中3～4h，然后用PBS透析24h，多次换液后，即为生物素标记物，保存备用。

3.生物素标记辣根过氧化物酶。

按上述生物素标记羊抗人IgG方法，制备生物素标记酶(HRP-Bio)。

4.ABC溶液配制。

在PBST中，分别加入avidin和HRP-Bio，使各自的最终浓度为8～12µg/m1和3～4µg /ml，置室温中混匀20～3Omin，即可应用。

通常在临用前3Omin配制。

5.操作方法。

在已包被抗原的40孔反应板凹孔中，加待检血清，如间接ELISA法孵育、洗涤后，加biotin-IgG，如上法孵育、洗涤，再加ABC洗涤，于37℃经l5min，洗涤后加底物(邻苯二胺OPD)，置37℃经l0～l5min，最后用2mol/LH2S04终止反应，用酶标检测仪测定待检血清OD值。

检测时每一待检血清作2份，求得均值。

6.反应标准。

以健康人测得的OD均值，加2个标准差作为标准值(N)。

求每一待检血清的OD值(P)与N值的比值。

以P/N≥1.5～2.0，作为阳性，否则为阴性。

（九）皮内试验
1.弓形虫变应原的制备。

用人工感染弓形虫的小白鼠，收集其含有弓形虫的腹水，以离心法将虫
体浓集，将虫体充分洗净，冷冻干燥，研磨成粉，加生理盐水100倍稀释，加入防腐剂（0.01%硫柳汞）。

浸液应不断搅动，在冰箱中冷浸约需3～7天，而后离心沉淀，取其上清夜，用蔡氏滤器除菌或用间歇法灭菌。

滤出液即可作为变应原。

2.皮内反应。

用灭菌生理盐水将干燥的弓形虫变应原稀释成300～500倍后，以结核菌素注射器注射于猪的耳根部皮内0.2ml，同时于另一侧耳根部皮内注射生理盐水0.2ml作对照；在注射后的48小时观察其皮肤反应，当红肿面积直径超过15mm时为阳性，10～15mm为疑似，9mm以下为阴性。

本反应只在猪患本病的晚期才呈现，因此本法仅适用于流行病学调查，以查出慢性及隐性弓形虫病。

（十）琼脂扩散
原理：琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1%琼脂凝胶的孔径为0.085µm，允许各种抗原抗体在其中自由扩散，抗原抗体在琼脂凝胶中扩散时，由近及远形成浓度梯度，当两者比例适当处相遇时，即发生沉淀反应，反应的沉淀因其颗粒较大，故在凝胶中不再扩散，而形成沉淀带，并成为屏障，继续扩散而来的相同抗原抗体就使沉淀带加厚而不再向外扩散。

通常用于诊断寄生虫病的方法是双向扩散，简称琼扩。

1.抗原制备。

参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。

2.操作方法。

取琼脂1g，加生理盐水100ml，在沸水浴中溶解，待稍冷时倒入玻璃培养皿，使成3mm 厚度，冷却后用打孔器在琼脂上打孔，孔排列成梅花状，即中间一个孔，周围6个孔，中央孔与周围孔间距离均为3mm，周围各孔间相互距离大致相等。

然后将培养皿在酒精灯上加热，使其底部琼脂略有溶解，以便使孔周围琼脂与培养皿底紧密粘合。

在中央孔中加满抗原，周围孔中加满被检血清，每孔一份血清，盖上皿盖，置37℃温箱中1～2天，取出在深色背景前和斜射照明下观察中央孔与周围孔间有无白色线。

3.结果判定。

被检血清孔与中央孔间有白色沉淀线时，判为阳性，无时为阴性。

（十一）免疫金银染色法 (immunogold-silver staining,IGSS)
其原理是将血清学方法和显微镜方法相结合的一种新的免疫标记技术，它的示踪标记物是胶体金(colloidalgold)。

胶体金是由氯金酸(HAuCl)在还原剂(如白磷、抗坏血酸、鞣酸等)作用下聚合成一定大小(20～4Onm)的颗粒，形成带负电荷的疏水胶体溶液(金溶胶)。

由于静电作用而成为比较稳定的胶体状态，故称为胶体金.它能和生物大分子(如抗人IgG)相结合成为金标记抗体，能与抗原-抗体复合物结合，经银显影处理后，使金颗粒周围吸附大量银颗粒，在光镜下可见到黑褐色的金银颗粒，即为阳性反应，否则为阴性反应。

1.固相抗原制备。

取弓形虫，充分洗涤后，作成石蜡切片用于试验。

2.金标记抗体制备。

(1) 金溶液制备。

煮沸220ml双蒸水，加入2.8m1新鲜配成的1%柠檬酸钠溶液，然后在剧烈搅拌下加0.5m1 4%HAuCl4溶液，搅拌3Omin，即可获得大颗粒(20～4Onm)金溶胶，它的最大吸收峰为528nm。

这种规格的金溶胶适用于光镜和扫描电镜。

(2) 金溶胶标记兔抗人IgG。

①金标记兔抗人IgG。

将lOml金溶胶置于容器中，在磁力搅拌下，加入66μg兔抗人IgG，l0min后，加5%牛血清白蛋白（BSA）溶液2ml，使其最终浓度为1%，然后将标记物进行纯化。

②标记物纯化。

a 凝胶过滤法。

将上述标记物移入透析袋，用PEG(分子量20000)浓缩至原容积的1/10,置于4℃用8000r/min离心15min，将上清液装于0.8×2Ocm聚丙烯葡聚糖凝胶(sephaCrylS-400)，用0.02mol/L pH8.2 TBS缓冲液充分平衡后，再用含l%BSA-TBS缓冲液洗涤，以稳定金溶胶作用。

用含0.1% BSA的TBS
缓冲液洗脱，流速为2ml/l5min,分管收集，每管4m1/3Omin。

层析柱分为3个区带，下端是微黄色区带，为最先流出的大颗粒聚合物杂质;中间是明亮深红色带，即为金标记抗体，上端为含未标记蛋白的黄色区带。

收集中间数管深红色洗脱液，即为标记物。

b 离心法。

先将上清液用低速离心，除去在制备过程所形成的可见聚合物，然后再将上清液用600OO×g1h，收集5nm大小的金颗粒，或用1400O×glh，收集20～4Onm大小的金颗粒。

用1% BSA-TBS缓冲液将收集的金颗粒作1：20稀释时，在52Onm波段测定不同大小金颗粒的OD值为:5nm、2Onm和4Onm金颗粒分别为0.25、0.35和0.5。

用比色法可鉴定金颗粒的质量。

3.操作方法。

将切片抗原置于0.5mol/L pH7.4 TBS作用2OOmin，洗涤后，加10%兔血清A液，lOmin 后弃去，加入已稀释的待检血清，置37℃2h(或4℃2Oh)，用0.5mol/L pH7.4 TBS液洗涤3次，每次5～lOmin,用0.O2mol/L pH8.2 TBS液洗涤5～lOmin。

再加10%兔血清B液，5～lOmin后弃去，加1：10稀释的金标记抗体，于37℃经lh，用0.O2mol/L pH8.2 TBS液洗3次，每次5～lOmin，再用双蒸馏水如上法洗涤3次。

然后在避光下，于显影液A液中作用3～5min，再于混合液(显影液A液85ml加B液l5ml)中染色5～lOmin，用蒸馏水冲洗，吹干后，在光镜下检查反应结果。

4.反应标准。

阴性反应：虫体切面呈无色或淡棕色。

阳性反应:虫体切面呈褐黑色。

附：免疫金银染色法试剂配制
0.02mol/L，pH8.2TBS缓冲液：
Tris 4.84g
NaCl 17.50g
蒸馏水 l5OOml
混匀后用浓HCI调至pH8.2，加蒸馏水至20OOml.
0.05mol/L pH7.4TBS缓冲液：
Tris l2.1g
NaCl 17.5g
蒸馏水 15OOml
混匀后用浓HCI调至pH7.4，再加蒸馏水至20OOml。

10%正常兔血清：
A液:9ml O.5mol/L pH7.4 TBS+1ml兔血清+2OOmgBSA。

B液:9ml O.O2mol/L pH8.2 TBS+lml兔血清+2OOmgBSA。

显影剂：
A液:对苯二酚850mg、柠檬酸2.55g、柠檬酸钠2.35g、双蒸馏水85ml。

B液:硝酸银95mg、双蒸馏水15ml。

四、实验报告
1．简述本次实验的实验目的、诊断技术的操作过程及实验结果。