肿瘤组织库存标本的质量控制

肿瘤组织库存标本的质量控制作者：和钢孟庆勇张顺李克强李旭军

【摘要】目的：通过对库存肿瘤标本的质量控制，为临床及科研提供有研究价值的标本。方法：收集已储存的组织标本，采用RT PCR技术对其RNA、DNA和蛋白的降解进行质量检测。结果：通过对已保存的肿瘤组织标本随机质量检测，所储存的标本质量符合分子生物学实验要求。结论：本组库存肿瘤标本无组织降解。

【关键词】肿瘤标本质量控制

随着临床肿瘤研究的日益深入，大量有研究价值的肿瘤标本已被充分利用。而标本的库存质量，对恶性肿瘤的研究形成了制约。基于目前国内建立临床肿瘤标本库的经验及意义，我实验室对库存肿瘤标本，通过提取组织mRNA进行了RT PCR、RNA、DNA电泳进行蛋白降解的质量检测。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂液氮罐、-80℃低温冰箱、高速离心机(细胞分离)、二氧化氮培养箱、图像分析系统等;Universal 基因组DNA提取试剂盒、PrimeScript RT PCR 试剂盒、PerfectShot Ex Taq 试

剂盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerse 、Wide Range DNA Marker 均购自TAKARA公司。

1.2 标本采集与贮存每例标本包括：离体后的瘤组织、癌旁组织和血标本。组织离体后(不影响病理诊断)取瘤组织0.5cm×0.5cm ×0.5cm/份，3～5份/例;另取癌旁组织0.5cm×0.5cm×0.5cm/份，2～3份/例。取静脉血5～10ml，分装两份进行血细胞分离离心保存。另外，对于使用新鲜标本的，保存于培养液、PBS液及核酸保护剂内。所有标本30min内置于-80℃低温冰箱长期保存，并登记。

1.3 管理与质量控制管理模式：由具体负责人对日常工作的运行进行独立管理。组成结构：肿瘤标本库、临床病理资料数据库、生物样品库、组织库、血清库、血浆库;人员资格：专业培训(取材、转运、收藏、编号、录入、出库);质量控制：定期按每20个序号分析标本的DNA、RNA和蛋白质，监控其质量，确保标本资源经长期保存不受破坏和降解。

2 结果

2.1 库存资源库内保存有肺、食管、乳腺、肝、胃、肠等恶性肿瘤血和组织标本242例(1210份)，其中全套标本137例(包括癌组织、癌旁及血清)。每例组织标本都备有切片和相关的病理诊断，部分标本有照片。 2.2 质量检测标本来源：随机(每3个月)取组织库冻存标本3份。数据库编号：G

0003(胃癌);C0007(直肠癌);TH0001(甲状腺癌);实验编号：2/5(RNA/总DNA)胃癌;3/6(RNA/总DNA)直肠癌; 4/7(RNA/总DNA)甲状腺癌。1表示分子量对照，2～7代表被检测标本电泳。引物合成：根据GenBank资料，使用Primer Premier 5.0软件设计管家基因GAPDH、βactin引物，分析扩增产物的含量，通过Oligo 6.0软件验证。产物量相对较少或无产物，可判断为不可使用样本。引物由TAKARA公司合成。

将总RNA、基因组DNA进行电泳，用RT PCR方法从总RNA 中逆转录并扩增GAPDH、βactin检测mRNA的完整性，用PCR方法从基因组DNA中扩增GAPDH基因检测DNA的完整性。提取的3份RNA 条带亮度在2000bp，DNA条带亮度在10000bp,见图1。图1 样本PCR 扩增电泳图通过检测样本中βactin的蛋白表达量变化，分析印迹条带，判断蛋白量是否有变化，无条带或条带变弱者为发生组织降解样本。本组3份样本2～4、5～7与1的分子量对比条带亮度无组织降解样本。

3 讨论

注重标本的质量控制，应严格按照《肿瘤组织标本库及常用技术手册》[1]的相关要求，使标本对应的临床病例资料有科学和丰富的信息含量。充分利用计算机信息化管理系统(参考北京大学临床肿瘤

学院肿瘤标本库资料)，进行信息录入、储存、检索以及数据维护、管理等功能，是建立肿瘤标本库的关键。

笔者体会，合格肿瘤标本应具备：①标本的采集、处理、保存和使用，肿瘤标本包括组织标本、核酸RNA标本、血清、血浆和淋巴细胞等标本。标本采集强调在不影响常规病理或术中切片的条件下留足原始标本，如遇较大标本，可适当放宽采集范围。各类型标本均应立即行肿瘤库冻存，要求组织离体后30min内将组织置入-196℃液氮速冻或-80℃深低温冷冻保存，血标本离心后分别冻存。组织标本的离体时间对于标本的保存质量至关重要，虽然有报道认为正常的乳腺组织在外科切除3小时仍能保持RNA的完整性，但多数学者推荐标本应在切除后30min内取材并保存[2，3]。技术要求在于取材部位的准确性，包括肿瘤组织和瘤旁组织分界的确定，笔者要求瘤旁0.5cm。

②为了保证标本的质量和完整性，还要避免基因组DNA、RNA和蛋白的降解，对库存标本定期随机抽样进行总RNA 提取鉴定。笔者对库存标本的检测表明，规范的采集和保存，尤其要防止反复冻融，是标本符合研究条件的重要因素。③相关信息的储存、管理和统计。由于标本及信息量大且处于动态变化之中，整个过程有标本的标记和储存、信息化管理、组织标本的解冻复苏以及质量控制等。因此，笔者结合肿瘤标本数据处理系统要求，设计了病例资料数据库、标本储存数据库、提取标本数据库、动态背景资料数据库，专人管理与录入。严格操作规程，对潜在、已知的危害进行定义和分类，制定相应书面规程，如入、出库的登记，存留标本的数量等。

应具备的条件: ①稳定的肿瘤标本来源。②良好的临床病理诊断条件,以保证库存标本的科学性和可用性。对一时尚未确诊者可先立另册,等确诊后再行入库。③有经验的临床或检验人员具体负责和操作。④具备-80℃以下的低温冰箱或液氮保存装置。⑤规范化肿瘤标本入库，贴有牢固的标签。⑥按规定程序对库存标本进行有关生化、细菌和真菌等方面的常规检查,以了解标本有无变质和受到污染。⑦应用信息化管理系统对肿瘤库存标本进行管理。

【参考文献】

1 季加孚,袁志宏,步召德.肿瘤组织标本库常用实验技术手册.北京:科学出版社，2006.2027

2 Isabelle M，Teodorovic I，Morente MM，et al.TuBaFrost 5: multifunctional central database application for a European Tumor Bank.Eur J Cancer，2006,42(18):31033109

3 Mager SR，Oomen MH，Morente MM，et al.Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples.Eur J Cancer，2007,43(5):828