凝胶电泳技术

DNA电泳条带模糊的原因（smear，涂抹状）： 1) DNA降解，应避免核酸酶污染。 2) 电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子 强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响 电泳效果；建议经常更换电泳缓冲液。
3) 所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过 20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应 ＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲 能力。
（二）染色剂 核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是 溴化乙锭染色法，其次是银染，目前还有其他安全的染 色剂。
溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一 个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特 异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基 插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基 团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作 用。这个基团的固定位臵及其与碱基的密切接近，导致 与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中 染料有所增加。 DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被 结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种 情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重 新发射出来。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液 （loading buffer）。 载样缓冲液的作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉 入加样孔内；
②在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳 的速度和位臵；
③使样品呈色，加样操作更方便。
配方： 将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF或分别，或同时加 入30%甘油水溶液，或40%（W/V）蔗糖水溶液，或15% 聚蔗糖(Ficoll400)中。用甘油和蔗糖配制的一般要4 度保存。
常用的凝胶电泳有两类 ： 琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分 子。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小 分子。
一、影响凝胶电泳迁移率的因素 （一）样品的物理性质 1、分子大小 线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数 （log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段 （线性双链）的分子量准确且方便。 EB嵌合使迁移率下降15%。 当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就 很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子 大小，因此，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大 小不宜超过此值。
自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和 对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支 持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程， 减少了扩散和对流等干扰作用。 凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术 的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物 大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝 胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
凝胶电泳技术
电泳（electrophoresis）：带电物质在电场中向相反 电极移动的现象 。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样 品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等 性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类。
TBE（Tris、硼酸、EDTA）：缓冲能力强，首选TBE。
TPE（Tris 、磷酸，EDTA）：缓冲能力强，但回收DNA 易与DNA一起沉淀，影响酶反应。
TNE（Tris 、醋酸钠，EDTA）：电流大，适合于长时间 低压电泳，分辨率高。
在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase， 保护DNA。
（三）电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯 度。 1-5V/cm低压时，线性DNA迁移率与电压成正比，而对 于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。
电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小。
高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降：因为 随电压上升，不同长度DNA泳动的增加程度不同， 凝胶有效分离范围随电压上升而下降 。 高压电泳（20-600V/cm（电场强度）,1000-2000V （电压））,必须用PAG作介质。
TBE一般配10 ×或5 ×的贮存液，都以1×TBE作 为使用液进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具 备足够的缓冲容量；进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓 冲液槽较小， 故通过缓冲液的电流量通常较大，需要 使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一 问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液或高压灭菌。
（2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： ① 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温 放臵1小时； ② 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。
银染： 银染色液中的银离子(Ag+ )可与核酸形成稳定的 复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+ 还原成银颗粒， 可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺 凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度 比EB高200倍。但银染色后，DNA不易回收。
2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同， 其迁移率也不同。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比 如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状 DNA（covalently close circular DNA，ccc DNA， 超螺旋构型） ＞lDNA（linear form，线型，质粒 的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA， open circular DNA, ocDNA，它的双链中的一条保 持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切 口）。
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和 溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。
3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5时分子 带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时核酸分 子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的 电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。
4、碱基组成： 对迁移率影响不明显，单链DNA形成 发夹结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA （1kb）。
（四）电泳缓冲液（种类、pH、离子强度）
Байду номын сангаас
1、pH值：决定带电颗粒的解离程度，缓冲液pH常偏 碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。
2、离子强度：离子强度小，溶液的导电性小，带电 颗粒泳动慢 ；离子强度大，溶液的导电性高，带电颗 粒泳动快（过高，产生大量热，胶熔化，或使DNA变 性）。
3、种类 ： TAE（Tris、醋酸、EDTA）：缓冲能力差，电流大，易 发热，长时间使用阴极为碱性 ，阳极为酸性 ，需要循环 使两极的pH一致；但价格便宜，分离大片段DNA效果较 好。
注意： EB见光易分解，应存棕色试剂瓶中于4℃下保存。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭 是强诱变剂，具有高致癌性！ 核酸吸收260nm紫外线 ，导致DNA的断裂，因此回收 DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对DNA的损 伤。 荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照 射。
(二)支持物介质（种类和浓度）
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。 琼脂糖是一种线性多聚体大分子。含有不同浓度的琼脂糖 的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围 的核酸分子。 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称 Bis)在交联剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N— tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵 (ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)的作用下聚合交联 成三维网状结构的凝胶，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例 决定，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE) 。 凝胶浓度越小，孔径越大；浓度越大，孔径越小 。
4) DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
5) DNA样品含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的 盐。
6) 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
7) DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释 DNA。
二、核酸电泳的指示剂与染色剂 （一）指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青（xylene cyanol, Xc） 呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁 移率比溴酚蓝慢。 在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝 的迁移率分别与1kb、 0.6kb、0.2kb和0.15kb的双链线 性DNA片段大致相同。 在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时， 二甲苯青 的迁移速 率分别与 2kb和 1.6kb的双链线 性 DNA大致相似。
由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合 DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴 化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的DNA 条带。
溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或 RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以 其荧光产率也相对较低。
染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量 DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进 行脱色。 EB存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低 15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如 DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况 下电泳，电泳结束后用EB染色。 EB在凝胶或染色液中的浓度为0.5 ug/ml或0.1ug/ml。
由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含 EB的溶液进行净化处理再行弃臵，以避免污染环境和 危害人体健康。 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： ①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； ②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等 量的2.5mol/L HCl，混匀，臵室温数小时； ③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。
电泳迁移率（m, electrophoretic mobility ）是指 在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速 度
迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子 的大小和缓冲液的粘度成反比。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场 作用下向正极泳动。 DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛 效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的 泳动率就不同，从而分出不同的区带。 为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应， 增加分子筛效应。
不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围 浓度%（W/V） 线状DNA分子的有效分 离范围（kb）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
5－60 1－20 0.8－10 0.5－7 0.4－6 1.2－3 0.1－2
DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
聚丙烯酰胺 浓度 有效分离范围（bp） 二甲苯青FF 3.5 5.0 8.0 12.0 15.0 20.0 1000－2000 80－500 60－400 40－200 25－150 6－100 460 260 160 70 60 45 溴酚蓝 100 65 45 20 15 12
电泳的基本原理： 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点 所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积，即F＝ QE。质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于 一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r 为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点 在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην 球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所 带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身 状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳 迁移率。