生物样品中生物大分子的分离纯化
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二、组织与细胞破碎
4、化学破碎方法：
通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。 •有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
5、其它方法
•溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的 稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
极性溶剂； • 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； • 温度升高，溶解度加大； • 远离等电点的pH值，溶解度增加。 • 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加
和保持其生物活性。
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三、初步分离提取
生物大分子一般提取方法：
⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶液为 主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解 度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或分子 中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、 稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
6
（三）、生物材料的选择和预处理
从工业角度考虑 从科研角度考虑 选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的 材料应含量高、来源丰富、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 材料选定以后要预处理
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂 中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
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三、初步分离提取
初步分离方法：
• 蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀 法，有机溶剂分级分离法等。
• RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、 苯酚法等。
• 特点：简便，处理量大，既能除去杂质 又能浓缩样品。
• 缺点：分辨率低。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
产生的剪切力将组织细胞破碎。 处理材料量较大时，使用之。 • 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软， 易于分散的组织细胞。科研上若材料处 理量少，可使用匀浆器。 • 研磨器
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二、组织与细胞破碎
2、物理破碎法：
• 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然 后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶 胀破碎。
生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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二、组织与细胞破碎
1、机械破碎法 • 高速组织捣碎机：利用高速旋转的叶片
生物样品中生物大分子的 分离纯化
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什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构 具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一 定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物 大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、多聚糖等。 实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生 物活性和在生物新陈代谢中的作用。
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二、组织与细胞破碎
3、酶学破碎方法 • 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、
纤 维 素 酶 等 ， 于 37℃ ， pH8 ， 处 理 15 分 钟，可以专一性地将细胞壁分解。 • 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定 的pH和适当的温度下，细胞结构在自身 所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶 等）的作用下发生溶解，使细胞使细胞 壁自行破裂，内含物被释放出来。
3
生物大分子分离纯化的特殊性
生物材料的组成复杂，种类极多。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步
骤多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，
因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制 备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、 离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难 准确估计和判断。
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生物大分子的理化性质
在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时和冻干时的稳定性。 物理性质： 分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电
场中的行为、 离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料 中的分配系数等。 化学性质： 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学 试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力等。
亲核层析
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定
（一）含量的测定
• 测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋 光法等。
• 测 定 蛋 白 质 和 酶 总 量 —— 凯 氏 定 氮 法 ， Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。
• 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁 和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。
• 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
• 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用 此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷 却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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六、产品处理
• 浓缩、干燥
浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶 液的过程。 浓缩的方法： ①沉淀法 ②蒸馏法 ③吸收浓缩 ④超滤法
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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三、初步分离提取
影响生物大分子提取的因素主要有：
• 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； • 由固相扩散到液相的难易； • 溶剂的pH值和提取时间等。 • 通常极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非
干燥：把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂 除尽的过程。 真空干燥 冷冻真空干燥
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六、产品处理
• 保存
• 保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂 或稳定剂，防止生物大分子变性失活。
1．干粉保存：0~4℃ 冰箱中保存即可（样品置于 干燥器中）。
2．液态保存：0~4℃ 冰箱即可。不能放在0℃ 以下， 因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。
• 测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。
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五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定
（二）纯度鉴定
• 蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用2~3种不同的鉴定 方法才能确定。
• 核酸的纯度鉴定从测A260/A280光吸收比值可判定样品 的纯度。 RNA，A260/A280≈2以上， DNA，A260/A280≈1.8左右,若DNA的A260/A280＞1.8，说 明制剂中存在RNA,需要考虑用RNA酶处理样品，提高 DNA纯度。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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一、前期准备
（一） 明确目的和要求 （二） 了解的生物大分子的物理化学性质
溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、pH
（三） 生物材料的选择和预处理
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四、精细分离纯化
• 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质， 必须根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大 小等差异对粗制品进行进一步分离纯化。
性质 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 生物功能专一性
具体方法
差速离心、超滤法、分子筛、 透析
盐析、有机溶剂沉淀、等电点 沉淀等
电泳、等电点聚焦、离子交换 层析、吸附层析、凝胶过滤法
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谢谢！
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等电点沉淀法
• 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式 存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)， 此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同 电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力 减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀， 所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小， 最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性 质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从 而有利于悬浮液的过滤。
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二、组织与细胞破碎
4、化学破碎方法：
通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。 •有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
5、其它方法
•溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的 稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
极性溶剂； • 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； • 温度升高，溶解度加大； • 远离等电点的pH值，溶解度增加。 • 提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加
和保持其生物活性。
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三、初步分离提取
生物大分子一般提取方法：
⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶液为 主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解 度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或分子 中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、 稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
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（三）、生物材料的选择和预处理
从工业角度考虑 从科研角度考虑 选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的 材料应含量高、来源丰富、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 材料选定以后要预处理
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂 中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
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三、初步分离提取
初步分离方法：
• 蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀 法，有机溶剂分级分离法等。
• RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、 苯酚法等。
• 特点：简便，处理量大，既能除去杂质 又能浓缩样品。
• 缺点：分辨率低。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
产生的剪切力将组织细胞破碎。 处理材料量较大时，使用之。 • 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软， 易于分散的组织细胞。科研上若材料处 理量少，可使用匀浆器。 • 研磨器
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二、组织与细胞破碎
2、物理破碎法：
• 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然 后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶 胀破碎。
生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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二、组织与细胞破碎
1、机械破碎法 • 高速组织捣碎机：利用高速旋转的叶片
生物样品中生物大分子的 分离纯化
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什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构 具有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一 定顺序和方式连接而形成的多聚体。常见的生物 大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、多聚糖等。 实际上生物大分子的特点在于其表现出的各种生 物活性和在生物新陈代谢中的作用。
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二、组织与细胞破碎
3、酶学破碎方法 • 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、
纤 维 素 酶 等 ， 于 37℃ ， pH8 ， 处 理 15 分 钟，可以专一性地将细胞壁分解。 • 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定 的pH和适当的温度下，细胞结构在自身 所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶 等）的作用下发生溶解，使细胞使细胞 壁自行破裂，内含物被释放出来。
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生物大分子分离纯化的特殊性
生物材料的组成复杂，种类极多。 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步
骤多，流程长。 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，
因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制 备最困难之处。 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、 离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难 准确估计和判断。
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生物大分子的理化性质
在水和各种有机溶剂中的溶解性。 在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 固态时和冻干时的稳定性。 物理性质： 分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电
场中的行为、 离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料 中的分配系数等。 化学性质： 对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学 试剂的稳定性。 对其他生物分子的特殊亲和力等。
亲核层析
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定
（一）含量的测定
• 测定多糖总量——菲林试剂法，蒽酮法，旋 光法等。
• 测 定 蛋 白 质 和 酶 总 量 —— 凯 氏 定 氮 法 ， Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。
• 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁 和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。
• 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
• 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用 此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷 却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
21
生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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六、产品处理
• 浓缩、干燥
浓缩：从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶 液的过程。 浓缩的方法： ①沉淀法 ②蒸馏法 ③吸收浓缩 ④超滤法
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
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三、初步分离提取
影响生物大分子提取的因素主要有：
• 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； • 由固相扩散到液相的难易； • 溶剂的pH值和提取时间等。 • 通常极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非
干燥：把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂 除尽的过程。 真空干燥 冷冻真空干燥
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六、产品处理
• 保存
• 保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂 或稳定剂，防止生物大分子变性失活。
1．干粉保存：0~4℃ 冰箱中保存即可（样品置于 干燥器中）。
2．液态保存：0~4℃ 冰箱即可。不能放在0℃ 以下， 因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。
• 测定核酸总量——定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。
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五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定
（二）纯度鉴定
• 蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用2~3种不同的鉴定 方法才能确定。
• 核酸的纯度鉴定从测A260/A280光吸收比值可判定样品 的纯度。 RNA，A260/A280≈2以上， DNA，A260/A280≈1.8左右,若DNA的A260/A280＞1.8，说 明制剂中存在RNA,需要考虑用RNA酶处理样品，提高 DNA纯度。
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生物大分子分离与纯化基本步骤
一、前期准备 二、组织与细胞破碎 三、初步分离提取 四、精细分离纯化 五、生物大分子含量的测定和纯化鉴定 六、产品处理：浓缩、干燥和保存
5
一、前期准备
（一） 明确目的和要求 （二） 了解的生物大分子的物理化学性质
溶解性、稳定性、亲和力、缓冲液、pH
（三） 生物材料的选择和预处理
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四、精细分离纯化
• 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质， 必须根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大 小等差异对粗制品进行进一步分离纯化。
性质 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 生物功能专一性
具体方法
差速离心、超滤法、分子筛、 透析
盐析、有机溶剂沉淀、等电点 沉淀等
电泳、等电点聚焦、离子交换 层析、吸附层析、凝胶过滤法
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谢谢！
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等电点沉淀法
• 在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式 存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)， 此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同 电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力 减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀， 所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小， 最易形成沉淀物。等电点时的许多物理性 质如黏度、膨胀性、渗透压等都变小，从 而有利于悬浮液的过滤。
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