EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725
《2024年胡麻EMS突变体库的构建及抗ALS类除草剂与高油酸突变体的鉴定分析》范文
《胡麻EMS突变体库的构建及抗ALS类除草剂与高油酸突变体的鉴定分析》篇一一、引言胡麻作为一种重要的油料作物，其抗逆性、抗病性以及油脂品质的改良一直是农业科学研究的重要方向。
近年来，随着基因编辑技术的发展，尤其是EMS（乙基甲磺酸盐）诱变技术的广泛应用，为胡麻突变体库的构建提供了新的途径。
本文旨在构建胡麻EMS突变体库，并对其中的抗ALS类除草剂和高油酸突变体进行鉴定分析，以期为胡麻的遗传改良提供新的基因资源。
二、材料与方法1. 材料本实验所用的胡麻种子来自多个品种，EMS诱变剂及其他试剂均为市售标准品。
2. 方法（1）胡麻EMS突变体库的构建采用EMS处理胡麻种子，经过一定时间的选择压力和繁殖，构建胡麻EMS突变体库。
（2）抗ALS类除草剂突变体的鉴定通过对突变体库进行除草剂处理，观察并记录各突变体的抗药性表现，进一步采用PCR技术、测序等分子生物学手段，验证并鉴定出具有抗ALS类除草剂能力的突变体。
（3）高油酸突变体的鉴定分析通过对突变体库的油酸含量进行检测和分析，结合遗传学、生物学特性，鉴定出具有高油酸含量的突变体。
三、结果与分析1. 胡麻EMS突变体库的构建结果经过EMS处理和选择压力的筛选，成功构建了胡麻EMS突变体库。
该库包含了多种性状和基因型的突变体，为后续的鉴定分析提供了丰富的基因资源。
2. 抗ALS类除草剂突变体的鉴定分析通过除草剂处理和观察，我们发现部分突变体表现出对ALS 类除草剂的抗性。
进一步通过PCR技术和测序验证，成功鉴定出具有抗ALS类除草剂能力的突变体。
这些突变体在农业生产和环境保护方面具有潜在的应用价值。
3. 高油酸突变体的鉴定分析通过对突变体库的油酸含量进行检测和分析，我们发现部分突变体的油酸含量明显高于其他品种。
结合遗传学和生物学特性，我们成功鉴定出具有高油酸含量的突变体。
这些突变体在提高胡麻油脂品质方面具有重要价值。
四、讨论与展望本实验成功构建了胡麻EMS突变体库，并对其中的抗ALS 类除草剂和高油酸突变体进行了鉴定分析。
EMS诱变水稻突变体致变基因的鉴定0725
EMS突变体致变基因鉴定在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。
采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。
在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。
常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。
随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。
根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。
方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。
该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。
方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量又可降低测序成本。
由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。
水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。
该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。
EMS_诱变创制水稻抗乙酰辅酶A_羧化酶抑制剂类除草剂种质
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ江㊀群ꎬ凌溪铁ꎬ唐兆成ꎬ等.ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(２):３０５￣３１２.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０２.００１ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质江㊀群１ꎬ㊀凌溪铁２ꎬ㊀唐兆成２ꎬ㊀周珍珍２ꎬ㊀张保龙１ꎬ２(１.海南大学热带作物学院/三亚南繁研究院ꎬ海南海口５７０２２８ꎻ２.江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４)收稿日期:２０２２￣１１￣２５基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２１)２０４１]作者简介:江㊀群(１９９８－)ꎬ女ꎬ四川宜宾人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事水稻抗除草剂育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１６９２５７９２６４＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:张保龙ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｂｌ２２４８＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎻ周珍珍ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈｅｎｚｈｅｎｚｈｏｕｎｊ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值ꎮ本研究以甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)水溶液诱变镇糯１９水稻种子ꎬ获得１株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)抑制剂类除草剂高效盖草能的Ｍ３代水稻幼苗(突变体)ꎮ分别扩增镇糯１９野生型和突变体的基因组ＤＮＡ并进行测序和序列比对ꎬ发现突变体ＡＣＣａｓｅ基因的开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基发生了点突变ꎬ导致编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸ꎮ镇糯１９野生型和突变体分蘖盛期大田喷施３种田间推荐剂量的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型ꎮ本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ＡＣ￣Ｃａｓｅ抑制剂类水稻新种质ꎬ具有一定的应用价值ꎬ为抗除草剂水稻育种提供了种质资源ꎮ关键词:㊀水稻ꎻ抗除草剂种质ꎻ甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)ꎻ乙酰辅酶Ａ羧化酶中图分类号:㊀Ｓ３３５.３㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０２￣０３０５￣０８ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｔｏｃｒｅａｔｅｒｉｃｅａｎｔｉ￣ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ￣ｈｅｒ￣ｂｉｃｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍＪＩＡＮＧＱｕｎ１ꎬ㊀ＬＩＮＧＸｉ￣ｔｉｅ２ꎬ㊀ＴＡＮＧＺｈａｏ￣ｃｈｅｎｇ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＺｈｅｎ￣ｚｈｅｎ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＢａｏ￣ｌｏｎｇ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ/ＳａｎｙａＮａｎｆａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｒｍｐｌａｓｍＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＢｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ/ＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｉｓｏｆｇｒｅａｔｖａｌｕｅｆｏｒｗｅｅｄｃｏｎｔｒｏｌｉｎｒｉｃｅｆｉｅｌｄｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＺｈｅｎｎｕｏ１９ｒｉｃｅｓｅｅｄｓｗｅｒｅｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄｂｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ｓｏｌｕｔｉｏｎꎬａｎｄａＭ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｗｉｔｈｓｔａｂｌｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅａｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ(ＡＣＣａｓｅ)ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｏｆｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗａｓａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎａｔｔｈｅ５３７４ｔｈｂａｓｅｏｆｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅＡＣＣａｓｅｇｅｎｅꎬｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎａｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｃｏｄｅｄ１７９２ｔｈａｍｉｎｏａｃｉｄｆｒｏｍｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｔｏｌｅｕｃｉｎｅ.ＴｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｗｅｒｅｓｐｒａｙｅｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄａｎｄｔｈｅａｇｒｏｎｏｍｉｃｔｒａｉｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｍｕｔａｎｔｔｏｈａｌｏｘｙ￣ｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌａｎｄｐｉｎｏｘａｄｅｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｅｗｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｗｉｔｈＡＣＣａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄꎬｗｈｉｃｈｈａｄｃｅｒｔａｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｖａｌｕｅａｎｄｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｒｉｃｅꎻｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍꎻｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ(ＥＭＳ)ꎻａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ５０３㊀㊀水稻是中国三大粮食作物之一ꎬ培育高产稳产的优质水稻是解决粮食问题的关键ꎮ稻田杂草严重影响水稻的产量和品质ꎬ杂草导致中国稻谷每年亏损率超过１５％ꎬ部分地区甚至超过５０％[１]ꎮ化学除草是当今世界使用最多的稻田除草方法ꎮ然而ꎬ过度使用除草剂不仅会导致杂草对除草剂产生抗性ꎬ还会对作物产生药害㊁降低水稻产量和品质ꎬ严重时甚至造成水稻颗粒无收[２]ꎮ因此ꎬ培育抗除草剂的水稻品种可以经济有效地解决稻田的杂草防除问题ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶(ＡＣＣａｓｅ)是植物初级代谢中脂肪酸合成的关键酶之一ꎬ其主要功能是将乙酰辅酶Ａ羧化为丙二酰辅酶Ａꎮ该反应是脂肪酸合成的第一步ꎬ也是限速的关键步骤[３]ꎮ脂肪酸不仅是功能物质甘油三脂的组成成分ꎬ还能转化为作为细胞膜组成成分的磷脂[４]ꎮ自１９５８年发现乙酰辅酶Ａ羧化酶可作为除草剂的作用靶标后ꎬ针对该靶标已开发了三大类除草剂并商品化应用ꎬ分别是芳氧苯氧基丙酸酯类(ＡＰＰ)[５]㊁环己烯酮类(ＣＨＤ)[６]和新苯基吡唑啉类(ＤＥＮ)[７￣８]ꎮ其中ꎬＡＰＰ类除草剂包括高效氟吡甲禾灵(Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌꎬ又称高效盖草能)㊁精喹禾灵(Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌ)㊁精恶唑禾草灵(Ｆｅｎｏｘａｐｒｏｐ￣Ｐ￣ｅｔｈｙｌꎬ又称骠马)㊁恶唑酰草胺(Ｍｅｔａｍｉｆｏｐ)和氰氟草酯(Ｃｙｈａｌｏｆｏｐ￣ｂｕｔｙｌ)等ꎮＣＨＤ类除草剂包括烯禾啶(Ｓｅｔｈｏｘｙｄｉｍ)㊁噻草酮(Ｃｙ￣ｃｌｏｘｙｄｉｍ)和环苯草酮(Ｐｒｏｆｏｘｙｄｉｍ)等ꎻＤＥＮ类除草剂有唑啉草酯(Ｐｉｎｏｘａｄｅｎ)ꎮ乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂主要被用于控制禾本科杂草ꎬ具有高效㊁低毒㊁对后茬作物安全等特点[９]ꎮ目前ꎬ水稻生产中登记并许可使用的乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂仅有氰氟草酯㊁恶唑酰草胺和环苯草酮ꎬ这极大限制了水稻生产中杂草的防治ꎮ因此培育抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂水稻ꎬ不仅可以拓宽稻田除草剂的选择和使用范围ꎬ还可有效控制稻田杂草的发生与危害ꎮ化学诱变是培育和筛选抗性除草剂作物种质资源的重要方法ꎮＥＭＳ是非常有效且负面影响小的化学诱变剂ꎬ被广泛应用于构建优良性状的水稻突变体[１０￣１２]ꎮ顾佳清等利用ＥＭＳ处理粳稻品种中花１１ꎬ从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体ꎬ经过后代的纯化ꎬ得到了一个可以直接推广应用的水稻突变新品系申化一号[１３]ꎮ陈忠明等通过ＥＭＳ处理籼稻９３１１ꎬ筛选出了大粒的突变体Ｍ３１６和长穗突变体９３１１ｅＲ[１４￣１５]ꎮ本课题组用ＥＭＳ诱变处理包括９３１１在内的多个水稻品种ꎬ成功筛选到多个抗咪唑啉酮类除草剂的突变体ꎬ进一步鉴定结果表明突变均发生在编码乙酰乳酸合成酶(ＡＬＳ)靶标基因上[１６]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变糯稻品种镇糯１９构建突变群体ꎬ用ＡＰＰ类除草剂高效盖草能去筛选诱变处理后的Ｍ２代幼苗ꎬ获得能稳定遗传的抗性植株ꎬ并对抗性植株的ＡＣＣａｓｅ基因位点突变㊁氨基酸序列变异进行鉴定ꎬ最后就３种不同ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂对获得的抗除草剂材料农艺性状影响进行分析ꎬ旨在为水稻抗除草剂育种提供依据和材料ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与试剂供试水稻材料镇糯１９由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供ꎮ试验所用除草剂的种类及相关信息见表１ꎮ表１㊀本试验所用除草剂Ｔａｂｌｅ１㊀Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ名称㊀类别来源推荐田间施用剂量(ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.)高效盖草能ＡＰＰ江苏中旗科技股份有限公司６４.８精喹禾灵ＡＰＰ天津中农立华农用化学品有限公司６０.０唑啉草酯ＤＥＮ瑞士先正达作物保护有限公司４５.０㊀㊀生物试剂甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)购自美国Ｓｉｇｍａ￣Ａｌｄｒｉｃｈ公司ꎬ２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司ꎬＣＴＡＢ购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司ꎮ１.２㊀镇糯１９水稻种子的ＥＭＳ诱变及抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体的筛选㊀㊀镇糯１９种子(Ｍ１代)清水浸泡２ｈ后ꎬ用质量浓度５ ０ｍｇ/ｍｌ的ＥＭＳ水溶液浸种处理１４ｈꎬ硫代硫酸钠中和３０ｍｉｎ后ꎬ将种子捞出并用清水冲洗５~６遍ꎮ将诱变处理后的种子播种于大田ꎬＭ１代植株成熟后ꎬ种子混收(Ｍ２代)作为突变群体库ꎮ从突变群体库中取Ｍ２代种子播种于大棚苗床ꎬ待水稻幼苗长至３~４叶期时喷施６４ ８ｇ/ｈｍ２ꎬａ.ｉ.高效盖草６０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期能ꎬ施药后２１ｄ观察记录水稻表型并将正常生长的水稻苗移栽至盆钵内ꎬ单株收获种子得到突变体种子(Ｍ３代)ꎬＭ３代种子播种后得到Ｍ３代幼苗ꎮ１.３㊀抗除草剂突变体ＡＣＣａｓｅ基因的ＰＣＲ鉴定和碱基序列分析㊀㊀从国家水稻数据中心数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｉｃｅ￣ｄａｔａ.ｃｎ/)获得水稻ＡＣＣａｓｅ基因(ＯｓＡＣＣꎬ序列号为ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ２２９４０)的碱基序列ꎮ根据ＯｓＡＣＣ基因的保守序列使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件进行特异性引物设计ꎬ共设计了８对引物ꎬ分别是ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１~Ｏｓ￣ＡＣＣ￣Ｆ８和ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１~ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８(表２)ꎮ表２㊀本试验所用引物Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ引物名称㊀序列(５ᶄң３ᶄ)ＰＣＲ产物长度(ｂｐ)ＯｓＡＣＣ￣Ｆ１ＧＴＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧ１４２２ＯｓＡＣＣ￣Ｒ１ＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ２ＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＣ１６１４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ２ＴＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＯｓＡＣＣ￣Ｆ３ＣＣＣＴＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧ１５９７ＯｓＡＣＣ￣Ｒ３ＡＡＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ４ＣＡＡＡＣＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＴＴＧＡＣ１６４１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ４ＴＧＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＴＧＡＧＡＡＯｓＡＣＣ￣Ｆ５ＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣ１６３５ＯｓＡＣＣ￣Ｒ５ＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ６ＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣ１６３１ＯｓＡＣＣ￣Ｒ６ＡＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＣＧＯｓＡＣＣ￣Ｆ７ＡＧＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＴ１６３４ＯｓＡＣＣ￣Ｒ７ＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＴＡＴＯｓＡＣＣ￣Ｆ８ＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧ１８６６ＯｓＡＣＣ￣Ｒ８ＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡ㊀㊀采用ＣＴＡＢ法[１４]提取水稻的基因组ＤＮＡꎬ取Ｍ３代三叶一心期的叶片０ ５ｇ放在带有１颗小钢珠的２ｍｌ离心管中ꎬ放到液氮中冷冻至叶片组织变脆ꎬ再将离心管放到频率为６０Ｈｚ的组织研磨机研磨２ｍｉｎꎬ然后加入４００μｌＣＴＡＢ提取液ꎬ离心管６５ħ水浴３０ｍｉｎ后ꎬ在通风橱中加入４００μｌ氯仿ꎬ充分混匀至提取液呈乳绿色ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ在离心期间标记好管号ꎬ将６００μｌ无水乙醇加入到已经标记好的１ ５ｍｌ离心管中ꎬ移液枪吸取上清液３００μｌ加到已经准备好的离心管中ꎬ上下颠倒混匀再沉淀１ｈ以上ꎬ１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎬ倒掉上清液ꎬ开盖ꎬ室温下风干１２ｈ至离心管底部有明显的白色ＤＮＡ沉淀ꎬ风干后加入灭菌蒸馏水２００μｌꎬ于－２０ħ保存ꎮ以Ｍ３代的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ采用２ˑＲａｐｉｄＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ或ＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ￣ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ聚合酶扩增ＯｓＡＣＣ基因的８个片段ꎮ用１％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎮ将条带大小正确的ＰＣＲ产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序ꎻ使用ＳｎａｐＧｅｎｅ６.０.２软件分析测序结果ꎬ明确野生型和突变体的ＯｓＡＣＣ基因碱基序列差异性ꎮ１.４㊀喷施除草剂后水稻农艺性状调查２０２２年在江苏省农业科学院试验基地进行镇糯１９野生型和突变株系对３种乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂耐受性试验ꎮ５月中旬播种ꎬ６月中旬插秧ꎮ试验设分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水对照４个处理ꎬ每处理２.５ｍˑ４ ０ｍꎮ移栽行距为０ ２５ｍꎬ株距为０ １５ｍꎮ按照常规大田生产进行浇水和施肥等田间管理ꎮ镇糯１９野生型和突变体幼苗移栽大田２７ｄ后ꎬ进行高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水(ＣＫ)的喷施处理ꎮ除草剂的用量见表１ꎮ各处理选择连续的２０株ꎬ在水稻喷施除草剂前以及喷施除草剂后３０ｄ㊁９０ｄ进行茎蘖数㊁株高㊁主茎旗叶长度等农艺性状调查ꎮ其中ꎬ喷药后９０ｄꎬ水稻已进入成熟期ꎬ统计的茎蘖数为成穗数ꎮ１.５㊀数据处理与统计分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１９进行数据处理ꎬ用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０.１软件进行统计分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀抗除草剂突变体筛选高效盖草能是一种内吸传导型除草剂ꎬＥＭＳ诱变的镇糯１９Ｍ２代水稻幼苗在３~４叶期喷施高效盖草能７ｄ后ꎬ绝大部分水稻幼苗叶片颜色变成浅绿ꎻ喷施高效盖草能２１ｄ后ꎬ敏感植株叶片几乎完全失去绿色㊁部分已经枯死ꎻ具有抗性的植株能继续正常生长ꎮ经大量筛选后ꎬ最终获得１株具有高效盖草能抗性的Ｍ２单株(图１)ꎬ成熟后收获单株种子ꎬ得到Ｍ３代抗性突变体ꎮ２.２㊀ＯｓＡＣＣ突变位点已知高效盖草能的作用靶标是ＡＣＣａｓｅꎬ植物对７０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质图１㊀喷施高效盖草能后筛选到的Ｍ２代抗性水稻植株Ｆｉｇ.１㊀Ｍ２ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｃｒｅｅｎｅｄａｆｔｅｒｓｐｒａ￣ｙｉｎｇｗｉｔｈ６４.８ｇａ.ｉ./ｈｍ２ｈａｌｏｘｙｆｏｐ￣Ｒ￣ｍｅｔｈｙｌ高效盖草能的抗性主要源于ＡＣＣａｓｅ基因的突变[１７￣１９]ꎮ为了确定突变体中靶标基因是否发生突变ꎬ我们用了８对引物对野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和抗性Ｍ３单株(镇糯１９￣１７９２)的基因进行扩增ꎬ全部都获得了与预期大小相符合的条带(图２)ꎮ㊀㊀上述ＰＣＲ扩增的产物经测序和碱基序列比对ꎬ发现相对于野生型ＯｓＡＣＣ的ＯＲＦꎬ突变体ＯｓＡＣＣ基因中存在一个点突变ꎬ其开放阅读框(ＯＲＦ)的第５３７４位碱基由Ａ突变成Ｔꎬ从而引起编码的第１７９２位氨基酸由异亮氨酸(Ｉｌｅ)突变为亮氨酸(Ｌｅｕ)(图３Ａ)ꎮＯｓＡＣＣ蛋白的全长有２３２７个氨基酸ꎬ将Ｏｓ￣ＡＣＣ蛋白全长氨基酸序列在ＮＣＢＩ的ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏ￣ｍａｉｎ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行保守结构域分析ꎬ发现其包含了４个结构域(Ｄｏｍａｉｎ):生物素羧化酶(ＢＣ)㊁生物素羧基载体蛋白(ＢＣＣＰ)㊁乙酰辅酶Ａ羧化酶中心(ＡＣＣｃｅｎｔｒａｌ)和羧基转移酶(ＣＴ)(图３Ｂ)ꎮ进一步的氨基酸序列分析结果表明ꎬ突变体中第１７９２位氨基酸的突变位于ＣＴ结构域ꎬ该突变类型与已报道的大穗看麦娘(Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ)的抗性位点突变类型是一致的ꎬ对应于其ＡＣＣａｓｅ氨基酸序列第１７８１位点ꎻ突变类型也相同ꎬ均由Ｉｌｅ突变为Ｌｅｕ(图３Ｂ和３Ｃ)[１７]ꎮ因此ꎬ突变体抗除草剂功能的获得是由ＯｓＡＣＣ氨基酸序列第１７９２位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸引起的ꎮ２.３㊀突变体的农艺性状在分别喷施高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯１４ｄ后ꎬ野生型植株生长均受到了显著影响ꎬ大部分植株叶片出现枯黄症状ꎮ突变体植株在分别喷施以上３种除草剂后ꎬ叶片仍然是绿色且可以正常生长ꎬ表明突变体对这３种除草剂均具有抗性(图４)ꎮ㊀㊀分蘖期分别喷施３种不同除草剂后ꎬ野生型和突变体株高㊁分蘖数及旗叶长度的变化如图５所示ꎮ结果显示ꎬ在喷施清水处理的情况下ꎬ野生型和突变体植株的株高在处理前(０ｄꎬ即幼苗移栽到大田２７ｄ)基本没有差异ꎬ但在处理后３０ｄ和９０ｄꎬ突变体的株高显著低于野生型的株高(图５Ａ)ꎻ两者在处理前㊁后的单株茎蘖数均无明显差异(图５Ｅ)ꎮ在分别喷施３种不同除草剂前(０ｄ)ꎬ野生型和突变体植株的株高和单株分蘖数都没有明显差异ꎬ但是在喷施处理后ꎬ两者受除草剂的影响表现出明显差异(图５Ｂ~图５Ｄ㊁图５Ｆ~图５Ｈ)ꎮ其中ꎬ在喷施高效盖草能３０ｄ和９０ｄ后ꎬ突变体的株高均显著高于野生型(图５Ｂ)ꎬ单株茎蘖数也显著多于野生型(图５Ｆ)ꎮ野生型对精喹禾灵和唑啉草酯都非常敏感ꎬ喷施田间推荐剂量后水稻植株均死亡ꎬ因此未统计喷药后的株高和分蘖数ꎬ而突变体对这两种除草剂表现出较强的抗性ꎬ所有植株存活且能正常生长ꎬ株高随时间逐渐增加(图５Ｃ和５Ｄ)ꎮ突变体的单株茎蘖数在精喹禾灵处理后随时间呈先增后减趋势ꎬ但经唑啉草酯处理后变化不明显ꎬ未出现明显增加现象(图５Ｇ和５Ｈ)ꎮ喷施清水处理的突变体旗叶长度显著短于野生型ꎻ高效盖草能处理后ꎬ突变体的旗叶长度显著长于野生型(图５Ｉ)ꎮ由于野生型在喷施田间推荐剂量的精喹禾灵和唑啉草酯后植株已经枯死ꎬ因此未能进行旗叶长度统计ꎮ综合以上结果ꎬ在田间推荐剂量下ꎬ突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型ꎮ３㊀讨论植物对除草剂的抗性机制包括非靶标和靶标抗性两大类ꎮ其中ꎬ非靶标抗性是由靶标基因以外的突变引起的ꎬ使植物对除草剂的吸收或转运率降低㊁螯合或代谢作用增强ꎻ靶标抗性是由除草剂的靶标基因发生突变引起的[２０]ꎮ现在已发现的大部分植物抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的抗性机制是由于ＡＣＣａｓｅ基因碱基突变引起氨基酸位点发生变异ꎬ这也是导致杂草抗药性产生的主要原因[２１￣２２]ꎮ截止８０３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｍ表示ＤＮＡｍａｒｋｅｒꎻ泳道１表示野生型ꎻ泳道２表示突变体ꎮＦ１~Ｆ８㊁Ｒ１~Ｒ８为引物ꎬ见表２ꎮ图２㊀镇糯１９野生型和突变体中ＯｓＡＣＣ基因的ＰＣＲ扩增结果Ｆｉｇ.２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＯｓＡＣＣｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔＡ:突变体(镇糯１９￣１７９２)中ＯｓＡＣＣ基因的Ｓａｎｇｅｒ测序色谱图ꎻＢ:ＯｓＡＣＣ蛋白结构域示意图ꎻＣ:野生型(镇糯１９￣ＷＴ)和突变体(镇糯１９￣１７９２)的羧基转移酶(ＣＴ)结构域氨基酸序列比对ꎮ图３㊀镇糯１９突变体中突变基因ＯｓＡＣＣ及其编码氨基酸序列分析Ｆｉｇ.３㊀ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｕｔａｎｔｇｅｎｅＯｓＡＣＣａｎｄｉｔｓｅｎｃｏｄｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎＺｈｅｎｎｕｏ１９ｍｕｔａｎｔ９０３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质镇糯１９￣ＷＴ㊁镇糯１９￣１７９２分别表示镇糯１９野生型和突变体ꎻＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ和Ｈ２Ｏ分别表示喷施高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯及清水处理ꎮ图４㊀镇糯１９野生型和突变体田间喷施不同除草剂后的表型Ｆｉｇ.４㊀ＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆＺｈｅｎｎｕｏ１９ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅａｎｄｍｕｔａｎｔａｆｔｅｒｓｐｒａｙｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ目前ꎬ杂草中已报道了十几种ＡＣＣａｓｅ氨基酸置换与其抗药性相关ꎬ分别对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ的７个氨基酸位点(均位于ＣＴ结构域内):第１７８１位㊁第１９９９位㊁第２０２７位㊁第２０４１位㊁第２０７８位㊁第２０８８位和第２０９６位[２２￣２５]ꎮ在以上这些突变中ꎬ以第１７８１位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅ最为普遍ꎬ对三大类不同的ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂都表现出高抗性ꎬ却没有适合度代价(Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔ)[２６￣２８]ꎮ本研究通过筛选ＥＭＳ诱变的镇糯１９水稻突变体ꎬ鉴定到了１个能稳定遗传的抗除草剂突变体ꎮ对突变体进行了基因鉴定ꎬ确定其编码靶标蛋白ＯｓＡＣＣ的第１７９２位氨基酸由Ｌｅｕ突变成Ｉｌｅꎮ该突变类型与已报道的突变类型一致ꎬ对应于大穗看麦娘ＡＣＣａｓｅ第１７８１位氨基酸突变ꎮ这是该突变类型使水稻获得多种ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂抗性的首次报道ꎮＥＭＳ是最常见的化学诱变剂ꎬ在植物的诱变育种中被广泛应用[２９]ꎮ本试验通过ＥＭＳ诱变镇糯１９种子ꎬ筛选到了抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻植株ꎬ突变体能耐受田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵和唑啉草酯ꎮ其中ꎬ喷施了田间推荐剂量的唑啉草酯后ꎬ镇糯１９野生型植株在处理３０ｄ后几乎全部死亡ꎻ喷施了田间推荐剂量的精喹禾灵后ꎬ野生型的植株在喷施３０ｄ后全部死亡ꎻ而突变体在分别喷施３种除草剂后ꎬ均未出现死亡现象ꎬ基本可以正常生长ꎮ所获得的抗性突变体对高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯的抗性水平均明显强于野生型ꎮ突变体和野生型的最小致死剂量或５０％抑制浓度(ＧＲ５０)㊁ＯｓＡＣＣ酶活性的差异尚有待进一步明确ꎮ大豆㊁棉花和玉米等转基因作物已在全球范围内进行了商品化生产ꎬ产生了巨大的社会效益和经济效益ꎮ目前为止ꎬ中国虽然有多种转基因作物已经被正式批准商品化生产ꎬ但进行大面积种植的仅０１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期Ｈ２Ｏ㊁ＧＣＮ㊁ＪＫ㊁ＺＬ分别表示喷施清水㊁高效盖草能㊁精喹禾灵㊁ꎬ∗∗表示在０.０１水平上极显著ꎮＮＤ表示没有数据ꎬｎｓ表示没有显著差异ꎮ图５㊀不同除草剂处理下的水稻株高㊁分蘖数和旗叶长度Ｆｉｇ.５㊀Ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔꎬｔｉｌｌｅｒｎｕｍｂｅｒａｎｄｆｌａｇｌｅａｆｌｅｎｇｔｈｏｆｒｉｃｅｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｅｒｂｉｃｉｄｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ有番木瓜和棉花ꎮ２００９年ꎬ农业部颁发了中国拥有自主知识产权的转Ｂｔ基因抗虫水稻生产应用安全证书ꎬ但目前中国尚未批准转基因水稻的商业化生产ꎮ因此ꎬ培育非转基因的抗除草剂水稻品种具有重要价值ꎮ上世纪９０年代晚期ꎬ美国路易斯安那州州立大学稻米研究中心通过ＥＭＳ诱变技术育成了一系列耐咪唑啉酮类除草剂(ＡＬＳ抑制剂类除草剂)的非转基因水稻品种ꎮ２００２年ꎬ巴斯夫公司开发了非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种Ｃｌｅａｒｆ￣ｉｅｌｄ在美国进行了商业化推广ꎬ解决了水稻种植的杂草稻危害问题[３０]ꎮ２０１８年ꎬ巴斯夫又在美国上市了非转基因水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａꎬ可以抗精喹禾灵ꎬ拟与抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ进行轮作并交替使用两种不同作用机理的除草剂ꎬ实现对杂草稻和其他一年生杂草的可持续性防控[３１]ꎮ本研究通过ＥＭＳ诱变筛选到的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂突变体ꎬ具有与抗除草剂精喹禾灵水稻品种Ｐｒｏｖｉｓｉａ类似的抗除草剂性状ꎬ可为中国非转基因抗除草剂水稻育种提供重要材料ꎮ４㊀结论本研究通过ＥＭＳ诱变筛选获得了可稳定遗传的抗ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的水稻突变体材料ꎬ可耐受３种不同田间推荐剂量的除草剂ꎬ具有一定的生产应用价值ꎮ野生型在喷施田间推荐剂量的高效盖草能㊁精喹禾灵㊁唑啉草酯后ꎬ株高和分蘖均受到严重抑制甚至死亡ꎬ但突变体基本能正常生长ꎮ突变体中ＯｓＡＣＣ突变基因编码蛋白质的第１７９２位氨基酸由Ｉｌｅ变成Ｌｅｕꎬ使其对ＡＣＣａｓｅ抑制剂类除草剂的耐受性显著提高ꎮ在当前中国转基因水稻尚未放开㊁公众对转基因作物品种存在疑虑的大背景下ꎬ本研究获得的非转基因抗除草剂材料具有良好的应用前景ꎮ１１３江㊀群等:ＥＭＳ诱变创制水稻抗乙酰辅酶Ａ羧化酶抑制剂类除草剂种质参考文献:[１]㊀董立尧ꎬ高㊀原ꎬ房加鹏ꎬ等.我国水稻田杂草抗药性研究进展[Ｊ].植物保护ꎬ２０１８ꎬ４４(５):６９￣７６.[２]㊀程艳勤.浅析除草剂对水稻的危害及治理[Ｊ].农技服务ꎬ２０１６ꎬ３３(６):１０９￣１１４.[３]㊀ＫＯＮＩＳＨＩＴＫＵＪꎬＳＨＩＮＯＨＡＲＡＫꎬＹＡＭＡＤＡＫꎬｅｔａｌ.Ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ:ｍｏｓｔｐｌａｎｔｓｏｔｈｅｒｔｈａｎｇｒａｍｉｎｅａｅｈａｖｅｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｎｄｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｆｏｒｍｓｏｆｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ３７(２):１１７￣１２２. 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[２７]ＭＥＮＣＨＡＲＩＹꎬＣＨＡＵＶＥＬＢꎬＤＡＲＭＥＮＣＹＨꎬｅｔａｌ.Ｆｉｔｎｅｓｓｃｏｓｔｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｍｕｔａｎｔａｃｅｔｙｌ￣ｃｏｅｎｚｙｍｅＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｌｌｅｌｅｓｅｎｄｏｗｉｎｇｈｅｒｂｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｂｌａｃｋ￣ｇｒａｓｓＡｌｏｐｅｃｕｒｕｓｍｙ￣ｏｓｕｒｏｉｄｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＥｃｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ４５(３):９３９￣９４７. [２８]ＷＡＮＧＴꎬＰＩＣＡＲＤＪＣꎬＴＩＡＮＸꎬｅｔａｌ.Ａｈｅｒｂｉｃｉｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＡＣＣａｓｅ１７８１ｓｅｔａｒｉａｍｕｔａｎｔｓｈｏｗｓｈｉｇｈｅｒｆｉｔｎｅｓｓｔｈａｎｗｉｌｄｔｙｐｅ[Ｊ].Ｈｅｒｅｄｉｔｙ(Ｅｄｉｎｂ)ꎬ２０１０ꎬ１０５(４):３９４￣４００.[２９]ＳＥＲＲＡＴＸꎬＥＳＴＥＢＡＮＲꎬＧＵＩＢＯＵＲＴＮꎬｅｔａｌ.ＥＭＳｍｕｔａｇｅｎｅ￣ｓｉｓｉｎｍａｔｕｒｅｓｅｅｄ￣ｄｅｒｉｖｅｄｒｉｃｅｃａｌｌｉａｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｌｙｏｂｔａｉｎｉｎｇＴＩＬＬＩＮＧｍｕｔａｎｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１４ꎬ１０(１):５.[３０]ＳＨＡＸＹꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＧＲＯＴＨＤＥ.Ｆｉｅｌｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔＣｌｅａｒｆｉｅｌｄｒｉｃｅ(ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ.)ａｔｎｉｎｅＬｏｕｉｓｉａｎａｌｏｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００７ꎬ４７(３):１１７７￣１１８５. [３１]ＣＡＭＡＣＨＯＪＲꎬＬＩＮＳＣＯＭＢＥＳＤꎬＳＡＮＡＢＲＩＡＹꎬｅｔａｌ.Ｉｎｈｅｒｉｔ￣ａｎｃｅｏｆＰｒｏｖｉｓｉａｒｉｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｑｕｉｚａｌｏｆｏｐ￣ｐ￣ｅｔｈｙｌｕｎｄｅｒｌａｂｏｒａ￣ｔｏｒｙａｎｄｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｅｕｐｈｙｔｉｃａꎬ２０１９ꎬ２１５(４):８３.(责任编辑:石春林)２１３江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第２期。
一个水稻白化致死突变体abl25鉴定及其基因定位
一个水稻白化致死突变体abl25鉴定及其基因定位作者：朱环环 刘艳霞等来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2014年第03期摘要：经Co60辐照的粳稻嘉花1号得到一个新的致死白化突变体albino lethal 25（abl25），该突变体从发芽至4叶期表现为白化苗，之后逐渐死亡.与野生型嘉花1号相比，abl25突变体的叶绿素含量和类胡萝卜素的含量大大降低，叶绿体结构不正常，说明其叶绿体发育受到严重阻碍，导致植物死亡.遗传分析表明：该突变体受一对隐性核基因（abl25）控制，进一步利用abl25与广占63S杂交的F2分离群体，将该突变体基因（abl25）定位于第2染色体上SSR标记RM424与Indel分子标记ID7330之间，随后利用新开发的分子标记和扩大群体将其定位在Indel分子标记ID9111和ID9261之间的150 kb内，发现abl25是一个新的水稻苗期白化致死基因.关键词：水稻；叶绿体；白化致死突变体；基因定位中图分类号： Q 344 文献标识码： A 文章编号： 10005137（2014）030238070 引言叶绿体是个半自主细胞器，它不仅是光合作用的重要场所，而且还负责各种代谢物的生物合成和储存[1]，一个具有光合活性的叶绿体的生成，需要光、质体和核基因组的控制，并伴随着类囊体膜的产生[2-3].越来越多的证据表明，叶绿体的生成是个高度被监管的过程，包括基因表达，蛋白生物合成以及选择性的蛋白质降解[4].所以，当叶绿体的发育受到阻碍的时候，会影响叶绿素合成，从而引起叶色异常[5-6]，甚至导致植株死亡[7].很多与叶绿体相关水稻突变体已经被发现，并根据不同的表型被命名为virescent （v），stripe （st），albino，chlorina，zebra，and yellowvariegated[8].在这些突变体中，v突变体在叶片生长早期表现为叶绿体不足，在后期生长中会产生大部分的绿色叶片[9].St为条纹状叶片突变体；chl突变体会产生淡绿色苗，是由于叶绿素的合成出现了问题[10]；至于zebra和 yellow variegated突变体，发生后大都不会导致它们的死亡.而水稻白化苗（albino），叶片一产生就发生白化，大多数在三叶期枯死.关于水稻白化突变体的研究目前也取得一些进展，日本的Iwata[12-13]等报道的11个水稻白化突变体al1al11，其突变基因位于第1，4，5，6号等染色体.夏久成等将一个返绿的白化突变基因al12，定位在第8染色体上[11].另外，通过白化致死突变体abl4 对研究，发现编码的ABL4蛋白定位于类囊体膜，推测ABL4基因是叶绿体正常发育过程所必需的[14].余庆波等将水稻白化突变体alb21的突变基因定位在第3染色体，并发现其叶绿体中只有一些空泡状结构[15]；白化突变体osalb23被定位在第2染色体上[16].巩孝帝[17]等水稻白化突变体asl1基因定在第1染色体，是编码核糖体白蛋白基因突变引起.本研究发现并鉴定了一个水稻白化苗突变体abl25，它的白化致死表型不受温度影响，对白化苗突变体的叶色表型、叶绿素水平，叶绿体超微显微镜进行观察和分析，并利用了SSR及InDel分子标记对该突变基因进行了定位，为该基因的分子克隆及其作用机理的研究奠定基础.1 材料与方法1.1 材料突变体abl25从粳稻“嘉花1号”干种子经60Coγ射线辐照后代获得.嘉花种子经过辐照之后发生突变（Aa），进行自交之后选取苗期分离出白化突变体的株系（上一代为杂合单株），随机选取4株生长正常的单株挂牌，收获挂牌的单株种子播种，根据后代分离情况确定上一代的基因型，弃纯合野生型单株，保留杂合单株.之后，突变体杂合子与籼稻广占63S杂交，得到F1代种子，自交后得到F2代分离群体，用于遗传分析与基因定位.1.2 方法1.2.1 突变体的表型观察为了进一步确定突变体abl25的表型，将突变体杂合子及其野生型嘉花1号的种子在32 ℃条件下催芽4 d后，播种在装有水稻土的塑料盆内，因为有好多温敏感的突变体被报道，为排除这种温度差异，将abl25突变体放置在20、24、28、32 ℃的光照培养箱（GXZ智能型，宁波，江南仪器厂）内，每天12 h光照（光照强度为180 μmol/m2·s）和自然条件（25 ℃）下，进行培养，观察突变体及其野生型叶色变化，并对其进行拍照.1.2.2 叶片光合色素含量的测定在上述32 ℃培养条件下，待突变体abl25与野生型嘉花1号长至3叶期时，参照沈伟其[18]描述的水稻叶片叶绿素浸提法.具体为取新鲜叶子1 g，加4倍的100%丙酮和少许石英砂进行在低温下研磨，收集匀浆液；倒入10 mL离心管中3000 r/15 min低温离心后取上清；若离心后沉淀物还呈现绿色则继续研磨离心，直至离心后下层无绿色为止.所有的上清用80%丙酮定容至50 mL，然后测吸光值.然后使用BECKMANCOULTERDU720分光光度计分别测定470、645、663 nm 3个波长下的吸光值，分别计算叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，重复3次，取其均值.1.2.3 叶绿体显微结构观察取上述在32 ℃条件下生长3周的野生型与abl25突变体叶片，用2.5%戊二醛和l %四氧化锇磷酸缓冲液4°下固定5 h后，用50%，70%，80%，95%，100%的乙醇和丙酮梯度下进行脱水，逐级脱5 min，最后用环氧化树脂包埋样品，切片后，经醋酸铀-柠檬酸铅双染色后，Hitachi765型透射电镜进行观察和拍照.1.2.4 构建定位群体突变体杂合子（ABL25/abl25）与籼稻广占63S杂交获得F1种子，收获单株种子播种，根据后代分离情况确定上一代的基因型，只保留杂合基因型（ABL25/abl25）的杂交种，获得能用于遗传分析F2代群体，选取表现为白化突变的单株提取DNA.1.2.5 水稻DNA的提取采用TPS法[19]以及CTAB[20]法，提取亲本以及F2代遗传群体基因组DNA.1.2.6 基因定位本研究中，首先选取本实验室的保存SSR及InDel的分子标记检测突变体abl25和广占63S的多态性，然后选取均匀分布在水稻12条染色体上的有多态性的引物，然后，随机挑选F2中分离出22株白化苗作连锁分析，确定突变基因在那条染色体上，接着进一步扩大F2群体进行遗传定位.在目标区域内通过 NCB公布的粳稻日本晴和籼稻9311的全基因组序列的差异InDel 位点，利用Primer Premier 5.0软件设计引物[引物由上海生工生物工程技术服务公司合成]（表 2），对突变基因进行进一步定位，应用MAPMAKER/EXP3.0[21]软件，构建目的基因区域的遗传图谱.PCR反应体系包括：100 mmol/L TrisHCl（pH=9.0）、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、80 mmol/L （NH4）2SO4、2.5 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物、5 U/mL Taq酶和20 ng模板DNA.在Eppendorf 和东胜PCR仪上进行扩增，PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s（退火温度随不同引物变化），72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min.反应产物用2.5%～3.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化乙锭染色后在UVP凝胶成像仪上成像，而对于多态性不明显的引物的PCR产物，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染之后用冷光源胶片观察灯观察，并拍照记录.2 结果与分析2.1 突变体的表型鉴定在20，24，28，32 ℃人工气候箱条件下以及自然条件下生长的突变体苗期表型均一致，不论发芽后首先长出的叶鞘，还是不完全叶，以及第2、3叶完全为白色，3叶期后，突变体逐渐死亡（图1），表明突变体abl25叶色的变化不受温度及其他外部条件所改变，是水稻苗期白化致死突变体.图1 abl25突变体的表型2.2 突变体光合色素的含量变化为了探究突变体中光合色素含量的变化，测定了野生型嘉花1号与突变型abl25的叶绿素，类胡萝卜素的含量，结果显示突变体abl25的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量明显低于正常水平，与野生型形成鲜明比对（表1），说明突变体中叶绿素的含量明显降低，可能为叶绿素合成受到的影响而导致.2.3 abl25叶绿体超细微结构的变化通过透射电镜观察野生型嘉花1号与abl25突变体的叶绿体超微结构发现，野生型嘉花1号的叶绿体密度无明显缺陷，可以看到井然有序的类囊体堆叠，而abl25突变体中无明显的类囊体堆叠结构，只有些空泡结构（图2）.这说明叶绿体的发育受到严重阻碍，导致abl25叶片内没有正常的叶绿体产生，叶绿素更是无法正常合成.2.4 遗传分析及基因定位在突变体杂合子分离后代中，绿色正常和白化致死苗分别为32和12株，其分离比符合3∶1（χ2=0.09图2 野生型和abl25突变体叶绿体的超微结构选取22株F2代白化苗进行粗定位分析，发现水稻第2染色体上的分子标记RM424，RM475（图3）有强烈的偏态扩增，因此，判断abl25位于第2染色体，然后扩大群体198株（图4A），将该基因定位在ID9047与 ID10317之间，其遗传距离分别为0.8 和8.4 cM.为了精细定位目标基因区域，定位群体扩大至4700株，将突变基因定位在ID9111到ID9261之间，物理距离约为150 kb（图4B），并发现ID9234与突变基因共分离.根据http：//ricegaas.dna.affrc.go.jp/和 http：//在该区间跨越了2个不重叠的BAC （AP005777.2和AP005631.3）克隆群，预测包含23个候选基因.3 讨论水稻不仅是重要的粮食作物，也是单子叶植物和禾本科的模式植物，水稻叶色突变体，越来越引起人们的研究兴趣，但是只有很少一部分白化突变体能够从分子水平作出阐释.比如，水稻白化突变体alb21无完整的叶绿体结构，只是些空泡结构，其定位在第3染色体上1520 kb 的区域内[14].同样的，abl4白化致死突变体没有成熟的叶绿体结构，只有些类似前质体的结构，以及部分囊泡状结构，定位第4染色体210 kb内；目前较为详细的是对白化突变体asl1的研究，表明asl1白化突变体是由编码核糖体白蛋白基因突变引起[17].到目前为止，与本研究abl25定位于同条染色体的已知突变基因有alb23[15]，其叶绿体中无类囊体及其他颗粒，定位在280 kb的区间内；以及gra（t）[22]，其在三叶期之前表现为白化苗，三叶期之后渐渐恢复绿色表型，定位于42.3 kb区间内.都与本文研究所确定在ID9111到ID9261之间150 kb内的位置完全不同，因此，abl25是一个新的白化突变基因.通过对ID9111到ID9261之间的生物信息学预测，发现其中共有23个候选基因，包括功能未知蛋白3个，其余20个编码蛋白的基因中，通过前导肽预测显示有1个叶绿体基因（LOC_Os02g16250）（http：//ipsort.hgc.jp/），查阅水稻基因表达预测网站（http：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/categoryselect.php）发现在叶片中高表达的基因有LOC_Os02g15660，LOC_Os02g15880，LOC_Os02g15900 LOC_Os02g16060，LOC_Os02g16250，通过对上述相关基因测序对比，显示在野生型和abl25突变体中没有差异，这说明上述候选基因可能与abl25白化致死无关.由于叶绿体自身所含有的蛋白或者定位于叶绿体以外的蛋白都可能影响植物叶绿体的正常发育[5].因此导致abl25白化致死的真正原因更是难以断定，有可能不是叶绿体蛋白基因突变引起的.本研究发现的abl25突变体，叶绿素和胡萝卜素的含量大大降低（图1），叶肉细胞超显微电镜观察发现突变体叶绿体中无任何堆叠的类囊体结构，叶绿体的形态不正常（图2），这都表明突变体的叶绿体形成在叶片发育过程中受到严重阻碍，导致叶绿素无法正常合成.更有趣的，定位过程发现在候选目标基因所在的9003～9234 kb区域之间，引物扩增的野生型DNA 条带非常清晰，而abl25突变体中暗淡或不清楚，推测ABL25基因的突变可能会对基因组的复制产生消极影响，影响突变体某些基因DNA的合成，类似现象在水稻virescent （v3）突变体到得证明[8]，但对于abl25来说还需要进一步验证.今后，将在此基础上扩大定位群体，发展更多新的分子标记，进一步对该基因进行克隆和功能分析，将有助于加深对水稻苗期白化致死作用机理的了解.参考文献：[1] MULLET J E.Dynamic regulation of chloroplast transcription[J].Plant Physiology，1993，103（2）：309-313.[2] LPEZJUEZ E.Plastid biogenesis，between light and shadows[J].Journal of Experimental Botany，2007，58（1）：11-26.[3] SAKAMOTO W，MIYAGISHIMA S，JARVIS P.Chloroplast biogenesis：control of plastid development，protein import，division and inheritance[J].The Arabidopsis Book，2008，6：e0110.[4] KATO Y，SAKAMOTO W.A new insights into the types and function of proteases 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人教版(新教材)高中生物必修2练习26：6 1 杂交育种与诱变育种课时作业
第1节杂交育种与诱变育种[对点强化]强化点1杂交育种和诱变育种1.育种专家用高秆抗锈病水稻与矮秆不抗锈病水稻杂交，培育出了矮秆抗锈病水稻，这种水稻出现的原因是（）A.基因突变B.基因重组C.染色体变异D.环境条件的改变[解析]使位于不同亲本的优良性状通过交配集中到同一个体上的方法即为杂交，是把原有基因重新组合的过程。
[答案] B2.我国航天科研工作者成功培育出了“太空花”。
下列相关叙述错误的是（）A.培育“太空花”的原理是基因突变B.从飞船上带回的实验植物并非都长成如愿的美丽“太空花”C.“太空花”是地球上原本不存在的物种D.“太空花”的出现丰富了自然界的基因种类[解析]“太空花”的出现是由于控制该性状的基因发生了突变，产生了新的基因，从而丰富了自然界中基因的种类，但并未产生新物种，只是个别性状的改变，由于基因突变具有低频性、不定向性，所以实验植物并非都长成如愿的“太空花”。
[答案] C3.在红粒高秆的麦田里，偶然发现一株白粒矮秆优质小麦，欲在两三年内能获得大量的白粒矮秆麦种，通常用的育种方法是（）A.自交（杂交）育种B.诱变育种C.人工嫁接D.单倍体育种[解析]由于不确定突变出来的白粒矮秆个体是显性突变还是隐性突变，也就不能确定此个体是纯合子还是杂合子，只能进行自交，使之纯化。
因此，欲在两三年内能获得大量的白粒矮秆麦种，通常用的育种方法是自交或杂交育种。
[答案] A4.下列不属于诱变育种特点的是（）A.具有不定向性B.突变频率较高C.多数有害D.多数有利[解析]诱变育种的原理是基因突变，基因突变具有不定向性、低频性、多害少利性等特点；诱变育种常利用物理或化学方法来诱导突变从而使突变频率大大提高，而突变多数是有害的。
[答案] D5.下列各项措施中，能够产生新基因的是（）A.高秆抗病小麦与矮秆不抗病小麦杂交B.用秋水仙素处理二倍体西瓜得到四倍体C.用花药离体培养小麦植株D.用X射线处理获得青霉素高产菌株[解析]基因突变能产生新的基因，用X射线处理后获得青霉素高产菌株的原理是基因突变，而选项A的原理为基因重组，选项B、C的原理为染色体变异。
农作物EMS诱变研究进展
农作物EMS诱变研究进展中国邮政EMS，作为国内快递服务的领军企业，不仅在物流效率上持续改进，同时也致力于农业领域的科技创新。
近年来，随着农作物EMS诱变研究的深入，EMS在推动农业科技进步和提升农产品质量方面取得了显著成果。
农作物EMS诱变，即利用中国邮政EMS的物流网络，实现农作物的远程、快速、准确的寄送服务。
这种服务旨在解决农业领域中的一些难题，如农产品质量不稳定、运输效率低下等。
通过EMS诱变研究，我们能够更好地了解各种农作物在不同环境和气候条件下的生长特性，为农业生产提供更为科学的指导。
近年来，EMS诱变研究主要集中在改善农作物的抗逆性、抗病性以及提高产量等方面。
例如，通过EMS诱变技术，我们成功地培育出了抗旱、耐寒、抗病虫害的农作物新品种，显著提高了农作物的产量和质量。
EMS诱变研究还涉及如何利用科技手段对农作物的生长环境进行精确调控，从而实现农作物的优质、高产、高效生产。
中国邮政EMS在推动农作物EMS诱变研究方面发挥了举足轻重的作用。
EMS拥有覆盖全国的物流网络和先进的快递服务技术，能够为农作物寄送提供稳定可靠的平台。
EMS与各地的农业科研机构、农业大学等紧密合作，为农作物EMS诱变研究提供了强大的技术支持。
EMS还致力于提升农业科技人员的技能培训，加强农业科技成果的转化和应用。
展望未来，农作物EMS诱变研究将进一步拓展和深化。
我们期待通过不断地科技创新和技术突破，实现农作物质量的持续提高和农业生产的可持续发展。
中国邮政EMS也将继续致力于提升服务品质，为农业科技进步和乡村振兴贡献力量。
中国邮政EMS的农作物EMS诱变研究取得了显著成果，为农业科技创新和农村经济发展注入了新的活力。
通过与各地的紧密合作以及不断地研究和探索，我们相信农作物EMS诱变将在未来发挥更大的作用，为推动我国农业现代化进程做出更大的贡献。
随着科技的不断发展和进步，农作物育种技术也在不断创新和改良。
化学诱变育种作为一种重要的农作物育种方法，已经在国内外得到了广泛的应用和研究。
γ射线与EMS复合处理对水稻的诱变效应
γ射线与EMS复合处理对水稻的诱变效应
王彩莲;慎玫
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】1990(000)002
【总页数】1页(P53)
【作者】王彩莲;慎玫
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S511.103.5
【相关文献】
1.γ射线与EMS单一及复合处理对烤烟种子活力的诱变效应 [J], 史跃伟;任学良;王轶;孙艳霞;邬晓勇
2.γ射线与NaN3复合处理对烟草几种主要农艺性状的诱变效应 [J], 任学良;王轶;杨春元;史跃伟;王茂胜
3.γ射线与HNO2复合处理对辣椒M2代可见性状诱变效应的研究 [J], 琚淑明;巩振辉;吕元红
4.CO2激光与叠氮化钠,γ射线复合处理水稻的诱变效应 [J], 骆荣挺;张铭铣
5.^(137)Cs γ射线与叠氮化钠复合处理水稻的诱变效应 [J], 王彩莲;慎玫;徐刚;赵孔南;陈秋方
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EMS诱变技术在植物育种中的研究进展
EMS诱变技术在植物育种中的研究进展刘翔【摘要】甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulfonate，EMS）是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变。
在当前种质资源极为匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，采用EMS诱发突变技术创造有用基因资源具有极其重要的意义。
本文通过对EMS的诱变原理和技术要领、应用实例、以及该技术在现代分子生物学中的应用前景加以阐述，对EMS诱变技术在农业生产中的应用具有重要作用。
%Ethyl methane sulfonate is a normal chemical mutagen and induce high density of gene mutations.At pres-ent,germplasm and genetic resources are extremely scarce,it is significant to create useful genetic resource by EMS mu-tation.We state here the principles and technical characteristics,examples,and the outlook of its application in modern molecular biology,which is important for applying EMS mutagenesis techniques on agricultural production.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P197-201)【关键词】甲基磺酸乙酯;诱变剂;基因突变【作者】刘翔【作者单位】上海辰山植物园，中国科学院上海辰山植物科学研究中心，上海201602【正文语种】中文【中图分类】Q3190 引言变异是自然界物种进化和选择过程中一个重要的生理现象，是物种进化的原动力，也是保证生物多样性的前提。
EMS诱变技术在水稻育种中的应用
EMS诱变技术在水稻育种中的应用作者：邢飞王晓雪任旭东杨峰王伦马建来源：《南方农业·下旬》2016年第02期摘要综述EMS诱变的原理和关键技术，简述一些EMS诱变技术在水稻育种中的应用。
EMS对水稻成熟胚的愈伤组织的诱变、对水稻种子的诱变、对水稻幼穗的突变等；总结了EMS诱变育种技术存在缺点和不足；提出了今后EMS诱变技术应用在水稻育种方面的展望和发展方向。
关键词 EMS诱变；水稻；育种中图分类号：S336 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）06--03EMS（Ethy Methan Sulfonate）属于一种烷化试剂，是目前公认的一种最为有效且应用比较多的化学诱变试剂。
EMS诱变水稻所产生的突变体，后代分离的基因数量很少，且稳定性较好，但不同的株系之间产生的突变类型比较丰富[1]。
当前，水稻种质资源库新的基因极其缺乏、遗传资源日益枯竭的状态，采用EMS诱变水稻技术、创造有用目基因有重要意义。
对水稻分子育种提供理论基础。
1 EMS诱变的原理EMS诱变技术改变DNA的一些结构，通常它带有一个或者多个活性烷基，此烷基可以转移到电子密度高的碱基上，发生烷化反应，置换出氢原子，进而改变氢键的能力，使DNA结构改变。
其诱导表现为嘌呤和嘧啶的转换，DNA的N-7位置的H离子被活性烷基取代后，成为一个带正电荷的集团，易发生转变型突变和置换型突变两种遗传效应。
EMS诱变原理见图1。
图1 EMS诱变原理1.1 转变型突变烷化了的鸟嘌呤（G）不再与胞嘧啶（C）配对，从而造成G≡C碱基对变成T=A碱基对，EMS诱变大部分表现为转换型突变。
1.2 置换型突变活化的鸟嘌呤（G）由于糖苷键发生断裂，造成了脱嘌呤，而原来鸟嘌呤的位置成了一个空位，当DNA分子在下一步复制的时候，4种碱基都有可能进入到其互补位置，造成突变，但是这种现象的可能性较小。
2 EMS诱变的关键技术EMS具有操作比较简单、突变频率较高、突变专一及多效等优点，其诱变成败的关键技术如下。
水稻突变体介绍及鉴定(很详细)
RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。
植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。
为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。
2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。
1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。
Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。
研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。
T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。
我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。
大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。
由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。
我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。
2.2 水稻Tos17 反转录转座子创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。
水稻矮杆突变体ds插入位点与ds标记基因的分子鉴定
Molecular identification of Ds insertion sites and Ds-tagged genes in rice dwarf mutantAbstractMutants are important germplasm resources for crop genetic analysis and functional genomics research.Insertional mutations based on transposable elements are an important pathway for high throughput mutants.Ac/Ds transposable elements are the most widely used genetic elements for rice mutant libraries.Plant height is an important agronomic trait that directly affect the high yield and quality of crops in rice and other gramineous crops.In previous studies,we screened a dwarf mutant with Ds inserted from the Ac/Ds insertion mutant strain of japonica rice cultivar Dongjin(Oryza sativa L.var.Japonica cv.Dongjin).Using the mutant,this study was used to characterize the Ds insertion site and Ds marker gene in the genome.The aim of this study was to provide reference for the study of high quality and high yield rice breeding.The results of this study mainly include the following aspects:1.Preliminary Morphological and Physiological Identification of Dwarf Mutant. Compared with wide-type rice,the dwarf mutant showed dwarf height and large flag leaf angle.The data of the plant height,flag leaf and spike length.The results showed that the plant height of the mutant line(average plant height44.6cm)was significantly lower than that in wild-type rice(average plant height88.0cm).The flag leaf angle of the mutant line(74.3°)was significantly larger than that of wild-type rice(20.9°).2.Based on TAIL-PCR technique,the flanking sequences of the Ds insertion site of the dwarf mutant genome were amplified and separated by the combination of different degenerate primers and specific primers.Through NCBI-BLAST analysis,we found that the Ds element inserted in a gene which coding divalent ion transporter protein on chromosome3(gene="Os03g0147400",protein_id="BAS82290.1").3.The Ds-tagged gene contains three exons and two introns,with Ds is inserted in the third exon.This gene encoded a469amino acid with divalent ion transporter protein. The dwarf phenotype is derived from the insertion of the Ds element on the divalent iontransporter protein gene,The study illustrated that the gene was related to the divalent ions necessary for the normal growth and development of rice,and the normal plant height of rice was maintained by ion absorption,transport and distribution.4.RACE technology was used to validate the impact of Ds insertion to the structures and functions of the Ds-tagged genes.Bioinformatics analysis of the results showed that,compared with the wild type rice,the structure of the divalent ion transporter protein encoded by the dwarf mutant rice was changed by a mechanism called exon shuffling.The length of the second exon of the gene which encode divalent ion transporter protein had shortened from1214bp to590bp.The shorten exon contained parts of Ds sequences.5.Real-time quantitative PCR was used to detect the expression of Ds-tagged genes in mutants in different organs.The results of SPSS software showed that the expression of Ds-tagged gene was the highest in stem,followed by leaf,root and stamens.As a whole,we preliminary forecasted that the expression of Ds was the highest in the stem,and the Ds insertion induced the exonation of the related gene.The structure of the divalent ion transporter was changed and involved in the life activities of the rice of the necessary ions,functional molecules to absorb and transport obstacles,leading to rice plant phenotypic dwarf.Key words:Rice(Oryza sativa L);Dwarf mutant;Ac/Ds;RACE;Quantitative real-time PCRWritten by:Guo YanyanSupervised by:Sun Bingyao目录第一章文献综述 (1)1水稻功能基因组学研究现状 (1)2突变体库的创建背景和创建方法 (3)2.1物理和化学诱变构建水稻突变体库 (3)2.2插入突变构建水稻突变体库 (4)3Ac/Ds转座机制及插入位点的鉴定 (6)3.1Ac/Ds的转座机制 (6)3.2克隆插入位点侧翼序列的方法 (8)3.3转座子拷贝数的测定 (10)4基于RACE技术分离克隆水稻基因 (14)4.1RACE技术的基本原理 (14)4.2新型的RACE技术 (16)4.3RACE技术的应用 (17)5水稻株高与离子转运体蛋白的研究进展 (18)6本研究的目的与意义 (20)第二章Ac/Ds插入水稻矮杆突变体侧翼序列扩增及相关标记基因生物信息学分析 (21)1材料 (21)1.1植物材料 (21)1.2引物信息 (21)2方法 (22)2.1突变体水稻的筛选 (22)2.2水稻基因组DNA的提取 (23)2.3Ac/Ds双元件在水稻基因组上插入的PCR检测 (24)2.4Ds插入位点旁侧序列扩增的TAIL-PCR检测 (25)2.5Ds插入位点的侧翼序列的TA克隆及序列测定 (27)3结果与分析 (30)3.1矮杆突变体与野生型水稻的表型特征观察 (30)3.2矮杆突变体基因组Ac/Ds的插入 (32)3.3矮杆突变体Ds插入位点的侧翼序列 (33)3.4Ds插入矮杆突变体水稻相关标记基因的初步生物信息学分析 (34)4讨论 (38)第三章Ds插入水稻矮杆突变体相关标记基因结构变化的生物信息学分析 (41)1材料 (41)1.1植物材料 (41)1.2引物信息 (41)2方法 (42)2.1水稻总RNA的提取 (42)2.2总RNA反转录成cDNA (44)2.3总RNA反转录成cDNA的质量检测 (44)2.4RACE技术扩增水稻相关基因cDNA末端 (45)2.5目的片段的TA克隆及序列测定 (47)2.6水稻Ds相关标记基因cDNA序列的初步生物信息学分析 (48)2.7qPCR检测Ds标记基因的组织表达水平 (49)3结果与分析 (50)3.1水稻总RNA提取方法的比较 (50)3.2水稻总RNA反转录成cDNA的质量检测 (51)3.3RACE技术扩增水稻Ds插入位点相关标记基因的结构的cDNA末端..513.4水稻Ds插入相关标记基因信息的初步生物信息学分析 (52)3.5Ds标记基因在突变体不同器官中的表达分析 (54)4讨论 (55)第四章小结与展望 (58)1全文小结 (58)2展望 (59)参考文献 (60)硕士在读期间发表的论文 (74)致谢 (75)第一章文献综述1水稻功能基因组学研究现状进入21世纪，随着农业产业的发展和全球经济一体化的逐步形成，土地资源短缺，农业环境污染，传统技术育种困难，种质资源发掘、基因组育种技术亟需创新等这些都是我国种业正面临前所未有的严峻挑战[1]。
EMS诱变及其在构建花生突变体库中的应用
EMS诱变及其在构建花生突变体库中的应用杨秀丽;杨丽萍;宁东贤;赵玉坤;李楠【摘要】EMS具备的较高突变频率在作物育种上被广泛使用.目前栽培种花生遗传背景相同或相似,遗传变异率低,很难产生优异性状.育种家利用EMS对花生进行化学诱变,从后代中筛选、鉴定出一些优异突变体或目的基因.综述了EMS诱变原理与特点、诱变方法和材料的选择、后代突变体的筛选方法和EMS诱变在构建花生突变体库中的应用前景等4个方面.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2018(046)009【总页数】4页(P1577-1580)【关键词】EMS;花生;化学诱变;突变体库;应用【作者】杨秀丽;杨丽萍;宁东贤;赵玉坤;李楠【作者单位】山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000;山西省农业科学院小麦研究所,山西临汾041000【正文语种】中文【中图分类】S565.2花生是我国重要油料作物之一，种植面积近466.7万hm2，占全球的29%，总产居国内五大油料作物之首。
在我国，花生的消费主体是榨油，为了满足市场对花生油的需求、提高花生食品品质、延长货架寿命，选育优质专用型花生成为花生育种的主要方向。
在我国，几乎每年都有一些新育成的花生品种被推向市场，但绝大多数推广品种的亲本是“伏花生”和“狮头企”，或者是含有它们的血缘[1]。
优势新品种的选育决定于作物遗传基因多样性的丰富度，过多使用遗传背景相同或相似的亲本材料，会导致栽培种花生基因的大量流失，其遗传基础日益狭窄、遗传变异率低，使得有性杂交重组中无法创造新的基因变异，优异性状的产生受到限制，无法获得在农艺性状和品质上突出的花生品种[2]。
另外，花生是自花授粉作物，它的四倍体栽培种与其二倍体野生种之间存在的倍性差异以及远缘杂交不亲和性，阻碍了它们之间的基因交流，使得花生选育工作很难有突破性的进展[3]。
一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法[发明专利]
![一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/cc08d312fab069dc5122014b.png)
专利名称：一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法
专利类型：发明专利
发明人：赵变平,王建军,邵林生,杨俊伟,陈朝辉,李彦良,贾鑫,罗绮,王志虹,焦建伟
申请号：CN201810044896.1
申请日：20180117
公开号：CN107950388A
公开日：
20180424
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于玉米育种技术领域，具体涉及一种利用EMS诱变产生玉米突变体的方法。
包括花粉收集、花粉诱变处理和人工授粉步骤，其中收集的花粉除掉花药后，加入到EMS‑石蜡油溶液中，按以下步骤进行诱变：(1)在紫外灯下方照射30～60s，(2)避光搅拌20～30min，(3)在紫外灯下方照射15～30s，(4)避光搅拌15～20min；其中人工授粉前，在待授粉玉米植株的雌穗花丝上涂抹EMS‑石蜡油溶液，得到诱变处理花丝，然后进行人工授粉。
本发明利用紫外与EMS的诱变机理不同，将两种诱变方式相结合，通用性良好，还对花丝进行了诱变处理，使雌蕊中部分基因发生突变，突变率较高。
申请人：山西省农业科学院玉米研究所
地址：034000 山西省忻州市新建北路14号
国籍：CN
代理机构：西安铭泽知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：韩晓娟
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EMS突变体致变基因鉴定
在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。
采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。
在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。
常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。
随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。
根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略：
方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。
方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。
该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。
方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量
又可降低测序成本。
由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。
水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。
该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。
该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定
选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基因组DNA，按照标准的Illunima 建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。
（2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析
通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序列进行，找出测序数据中的SNP、InDel，对全基因组的SNP纯合度进行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认，从而锁定出突变表型相关位点及基因。
（3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证
根据生物信息学获得突变位点信息，利用Sanger测序进一步在突变体中进行验证。