免疫荧光检测呼吸道病毒

成人呼吸道感染病毒病原学检测
摘要: 目的了解哈尔滨医科大学附属第二医院成人呼吸道病毒感染的流行特征。

方法采用直接免疫荧光法（DIF），对2007年4月-2008年6月住院的399名16-87岁呼吸道疾病患者痰标本进行七种病毒检测。

结果399例患者中病毒检测阳性者54例，病毒总体阳性率13.53％。

首位病毒为呼吸道合胞病毒29例（7.27％）和流感病毒A型27例（6.77％），其次为副流感病毒3型17例（4.26％）、副流感病毒1型13例（3.26％）、腺病毒5例（1.25％）、流感病毒B型2例（0.50％）和副流感病毒2型2例（0.50％），混合感染22例（5.51％）。

64-87岁年龄组病毒检出率最高（18.12％），32-47岁年龄组病毒检出率最低（6.94％）。

肺炎、支气管炎、支气管扩张、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）均有病毒检出，其中以COPD检出率最高（16.67％），其次是哮喘（15.38％）。

结论病毒在成人呼吸道感染中占有重要的地位，感染主要集中在48-87岁年龄阶段（15.38％），COPD 和哮喘病毒感染率最高，以呼吸道合胞病毒和流感病毒A型最为常见。

关键词呼吸道病毒感染；成人
Abstract: Objective To understand the epidemiologic feature of respiratory tract viral infection in the adults of Harbin Medical University The Second Affiliated Hospital.Methods From April 2007 to June 2008, a total of 399 hospitalized adults were studied.Sputum were screened for virus by direct immunofluorescent (DIF) assay.Results Virus was identified in 54 patients ( 13.53%) .The most prevalent was respiratory syncytial viruses (RSV) (29, 7.27%) , followed by influenza A (27, 6.77%) , parainfluenza 3(17,4.26%) , parainfluenza 1(13,3.26%) , adenovirus (5, 1.25 %) ，influenza B (2, 0.50 %) , parainfluenza 2 (2, 0.50%) , and mixed viral infection(22, 5.51%).The highest virus detection rate (18.12%) occur in adults between 64 and 87 years, virus detection rate of the lowest (6.94%) exist in 37-47-year-old.Pneumonia, bronchitis, bronchiectasis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) have detected the virus, with the highest detection rate of COPD (16.67%), followed by asthma (15.38%).Conclusions Viruses still play an important role in respiratory tract infections in adults and was concentrated in the 48-87 age group(15.38%), the infection rate of COPD and asthma was the highest. Respiratory syncytial virus and influenza A virus was the most common types.
Key words Respiratory tract viral infection;Adults
材料和方法
1.研究对象2007年4月-2008年6月随机选择哈尔滨医科大学附属二院呼吸
科住院病人399例。

其中年龄16岁-87岁，男性214例，女性185例。

2.设备及试剂荧光显微镜（TS100），离心机（TGL20LM），漩涡混合器（XH-B），
37℃培养箱（SKP-02.500），直接免疫荧光试剂盒（3137，chemicon）。

3.病毒抗原检测
3.1标本收集和处理由专职护士将塑料导管经鼻腔插入7-8cm达到咽部以下诱
导吸取1-2ml分泌物于10ml无菌离心管中[1]，-40℃冻存。

实验时取出标本，向离心管中加入4-8ml冷PBS,4℃放置3-4个小时，用漩涡混合器震荡3-5分钟后，标本液转移入1.5mlEP管中，1000-6000r/min离心5-10分钟，弃去上清液，如果有粘液也一并弃去。

沉淀物再加入1ml冷PBS震荡3-5分钟，1000-6000r/min离心5-10分钟，再次弃去上清液。

沉淀物中加入适量PBS，调节细胞浓度到含纤毛柱状上皮细胞1.0×106/ml。

3.2细胞片制备微量加样器吸取上述纤毛柱状上皮细胞悬液20ul，点于预先用
4℃丙酮浸泡过的载玻片上。

室温下空气干燥后4℃丙酮浸泡固定10分钟。

3.3 免疫荧光染色用Chemicon直接免疫荧光试剂盒对所有标本进行直接免疫荧光检测。

筛查试剂中含有7种混合单克隆抗体,即腺病毒（ADV）、流感病毒
A(IFVA)、B型(IFVB)、副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)及呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体。

当筛查试验为阳性时,再用单一特异性单克隆抗体对标本进行鉴定检测。

按试剂盒说明一滴混合单克隆抗体或单一单克隆抗体置于标本上,37 ℃孵育，筛查为15分钟，鉴定为30分钟后,用PBS 洗片3次，每次3-5分钟，风干后封片。

封片剂由试剂盒提供。

在荧光显微镜下观察。

所有标本均涂两张载玻片，一张上面涂一个样点用于筛查,另一张载玻片上面涂七个样点，如筛查为阳性,则用涂有七个样点的载玻片进行鉴定实验。

3.4 阳性结果判定及对照设定荧光显微镜下读片，放大倍数为200倍。

如果样点中含有>=20个细胞,则认为此片是可以评价的。

筛查实验阳性：在荧光显微镜200倍视野下有>=2个柱状纤毛细胞呈明亮黄绿色荧光即为筛查实验阳性，否则为阴性。

鉴定实验阳性：在荧光显微镜下呼吸道合胞病毒及副流感病毒显示细胞浆染色,流感病毒及腺病毒为核染色或细胞浆内染色，否则为阴性。

由试剂盒提供阳性及阴性对照片作对照。

4.数据处理采用SPSS统计软件进行数据处理。

结果
1.呼吸道病毒种类分布399例入选病人中病毒检测阳性者54例，男27例，女27例，病毒感染率13.53％。

其中腺病毒感染5例（1.25％），呼吸道合胞病毒感染29例（7.27％），流感病毒A型感染27例（6.77％），流感病毒B型感染2例（0.50％），副流感病毒1型感染13例（3.26％），副流感病毒2型感染2例（0.50％），副流感病毒3型感染17例（4.26％），混合感染22例（5.51％）。

2.病毒检出率与年龄的关系
表1 呼吸道病毒检出率与年龄的关系
年龄组例数检出数检出率（％） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合感染16-23 22 3 13.64 1 2 2 0 0 0 0 1
24-31 19 2 10.53 0 2 1 0 1 0 1 2
32-39 27 2 7.41 0 2 0 0 1 0 0 1
40-47 45 3 6.67 0 1 1 0 0 0 2 1
48-55 52 7 13.46 1 4 5 0 1 0 1 3
56-63 96 12 12.50 2 5 7 0 3 0 2 4
64-71 70 16 22.86 1 8 8 0 5 0 7 7
71-79 48 4 8.33 0 2 0 0 0 1 1 0
80-87 20 5 25.00 0 3 3 2 2 1 3 3
3.呼吸道病毒种类的季节分布
表2 呼吸道病毒的年份、季节分布
季节例数检出数检出率（％） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合感染07春季 33 2 6.06 0 2 1 0 0 0 0 1
07夏季 91 20 21.98 0 10 11 0 5 0 2 7
07秋季 99 11 11.11 2 6 4 0 3 1 3 3
07冬季 73 8 10.96 1 5 5 0 2 0 4 5
08春季 93 13 13.98 2 6 6 2 3 1 8 6
08夏季 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4.不同疾病的病毒检出情况
表3 几种常见疾病的病毒检出情况
常见疾病例数检出数检出率（％） ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3 混合上呼吸道感染 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0肺炎 117 12 10.26 1 7 7 1 4 0 5 5支气管炎 38 5 13.16 0 5 1 0 2 0 1 2支气管扩张 35 3 8.57 1 1 2 0 0 0 1 1哮喘 13 2 15.38 1 0 2 0 0 0 1 1 COPD 60 10 16.67 1 4 4 1 0 2 2 2 5.混合感染检出情况
表4 七种病毒的混合感染情况
例数 ADV RSV IFVA IFVB PIV1 PIV2 PIV3
单独感染 1 14 9 0 2 1 5
混合感染 4 15 18 2 11 1 12
总数 5 29 27 2 13 2 17
讨论
直接免疫荧光技术检测病毒的抗原快速而准确，与间接免疫荧光相比，减少了非特异性反应而提高了特异性。

Chemicon呼吸道病毒的诊断方法经过WHO3个参考中心审评，结果可靠。

本文采用直接免疫荧光法检测痰标本中的病毒抗原，399例病人中，病毒检出率为13.53％，已有报道RSVIgM抗体的测定结果多在8.1％-46.2％，虽然方法不同，但本次结果与该报道接近，且本次研究检测痰标本，易被患者接受。

在所检测的呼吸道病毒中，首位病毒为呼吸道合胞病毒和流感病毒A型，分别占总阳性例数的53.70％和50％，其次为副流感病毒3型、副流感病毒1型、腺病毒、流感病毒B型和副流感病毒2型。

根据结果数据，病毒感染主要集中在48-87岁年龄阶段。

将年龄进一步划分
为四个组（岁）：16-31、32-47、48-63、64-87，各组病毒检出率分别为12.20％、6.94％、12.84％、18.12％，可见，64-87岁年龄组相对于其他年龄组更易受病毒感染，而32-47岁相对不易受病毒感染，可能与相应年龄阶段的免疫功能状态等因素有关。

呼吸道合胞病毒，流感病毒A型感染在各个年龄组检出率中均位于前列，是成人呼吸道感染的主要病毒病原。

呼吸道病毒感染有一定的季节性，文献报道以冬春季为最多见。

本研究显示各个季节均有病毒检出，病毒检出率冬春季低于夏秋季，主要原因是研究组没有收集到2007年3月、2008年2月的痰标本，结果统计时缺少这两个月份的数据，于是最后结果与文献报道结果相反。

从表3可以了解到除了上呼吸道感染没有检出病毒外，其余常见疾病均有病毒检出，其中以COPD检出率最高，为16.67％，其次是哮喘，为15.38％。

呼吸道合胞病毒、流感病毒A型、副流感病毒3型是肺炎、COPD的重要病原，在肺炎中，副流感病毒1型也不容忽视，而在COPD中，副流感病毒2型也很重要。

支气管炎中主要检出了呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型。

哮喘中未检出呼吸道合胞病毒，流感病毒A型起了重要作用。

另外，流感病毒A型在支气管扩张中检出率也列在首位。

腺病毒在肺炎、支气管扩张、哮喘、COPD中均有检出。

本次检测到混合感染22例，占总阳性例数的40.74％，提示混合感染率高是呼吸道病毒感染的一个特点，临床工作者应予以高度重视。

混合感染中以流感病毒A型和呼吸道合胞病毒最常见，副流感病毒3型、1型仅次之，其中两种病毒感染有10例，三种以上病毒感染12例，多重混合感染占较大比重。

从单个病毒来分析，流感病毒B型混合感染与总数比为2/2，副流感病毒1型为11/13，腺病毒为4/5，副流感病毒3型为12/17，流感病毒A型为18/27，呼吸道合胞病毒为15/29，副流感病毒2型为1/2，这七种病毒参与混合感染的比重都很大。

成人呼吸道病毒感染的检测近年来越来越受到人们的重视，APAAP碱性磷酸酶标记、免疫荧光、PCR、IgM-ELISA等检测方法的出现，使呼吸道病毒的准确、快速检测成为了可能。

呼吸道病毒的检测对于呼吸道疾病的诊断和治疗有非常重要的指导意义，同时可了解病原谱的变迁，掌握其变化规律，为预防疾病，控制疾病的流行提供依据。

在一定程度上，也为合理使用抗生素提供了客观的病原学依据。

参考文献
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,2004 ,16（8）: 5～6.
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