全内反射荧光显微镜介绍
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全内反射荧光显微镜介绍
（一）棱镜型全内反射荧光显微镜
▪ 利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
全内反射荧光显微镜介绍
评价
棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。
目前使用CCD 探测,
全内反射荧光显微镜利用消逝波照
可达到的量子产率
射样品并使其成像成为可能，也成 就了其高信噪比。
已到～80 % ,成像
速率～200 全内反射荧光显微镜介绍 Hz.
全内反射显微镜的分型及其结构
▪ 全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型
两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
全内反射荧光显微镜 的基本原理
全内反射荧光显微镜介绍
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
荧光激发原理
全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波 激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受 到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面， 单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其 它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm 甚至更低的空全间内分反射辨荧率光显。微镜介绍
物镜型全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜介绍
05级医学实验 宋一萌
全内反射荧光显微镜介绍
• 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生
的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。
• 当今世界上研究单分子科学最具前途的新
90年代
20 新型物镜透镜、聚光 世 镜和超灵敏探测器的 纪 出现，使TRIFM技术
得到充分发展。
80年代早期
Axelrod等生物物理
20学家对TRIFM技术 世 及基本原理进行描 纪 述，并探索了其生
物应用。
全内反射荧光显微镜介绍
1965年
Hirsch field
完成了 第一个 全内反射 荧光实验
荧光激发原理
snell定律:
n1sin θ1=n2 sin θ2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射荧光显微镜介绍
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
荧光激发原理
非均匀波
沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数全衰内反减射荧。光显微镜介绍
表示未被激发的荧光分子。
CCD相机的快速成像特点提 高了其时间分辨率，使得观察单分 子的运动、细胞物质的分泌、蛋白 质的相互作用成为可能并成为这方 面的优势观察仪器。
wenku.baidu.comCCD相机
当对活细胞 成像时,为了 达到单分子 级的灵敏度 或是为了减 少曝光时间, 需要采用图 像增强器。
CCD相机的高灵敏度特点使
1995年
1996年
Yanagida小
Moerner小组
组用TIRFM技
又用这项技术
术首次在液体 这是首实次现尝了试限用制全在内反射荧光
溶液中得到了 法测液丙体烯中酰的胺单胶个体分子的荧光。
荧光标记的单 将全反的射纳理米论孔与中生的物细胞的荧
个蛋白质分子 的成像。
光的突成破像单成。技分像术子。相的结三合维是一种全新
▪ NA = nsin（u/2） ▪ nsin（u/2） > nsinθc ▪ NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的
折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全 反射的临界角。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
二者比较
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
棱镜型全内反 射荧光显微镜
隐失波的强度-深度图
荧光激发原理
T12（θi）- 分界面处的透射强度 θi - 入射角 d 12 - 渗透深度 λ - 入射光波长
透射强度和浸透深度公全内反式射荧光显微镜介绍
对于可见光波长 380 ～ 780nm而言，
浸透深度为～ 100nm。
箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。 黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点 全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
发展历史
全内反射荧光显微术的发展历程
在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显 微中的几个重要问题：
1.显微图像的信噪比不高； 2.光源对生物样本照射的损伤； 3.光学衍射所致的分辨极限（R ≥0. 61λ/nsinθ）：
传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响, 存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsin(u/2) ,其中R为分辨 力 ,λ为成像光波波长, nsin(u/2)为物透镜的数值孔径,即NA 值，u为 孔径角,因此光学显微镜空间全内分反射辨荧极光显限微镜～介2绍50 nm。
全内反射荧光显微术的发展历程
近年来人们开发出了一系列光学显微镜。 其中，全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)是 近年来新兴的一种光学成像技术。
全内反射荧光显微镜介绍
肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生， 荧光标记驱动蛋白动态研究。
在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。
放置样品的空间受到棱镜的限制。
全内反射荧光显微镜介绍
（二）物镜型全内反射显微镜
收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜
发生全内反射的光学器件。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
▪ 由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 , 因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为：
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜介绍
发展与展望
优势应用
分型及结构
基本原理
发展历史
全内反射荧光显微镜介绍
发展历史
荧光显微镜的概念
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。
（一）棱镜型全内反射荧光显微镜
▪ 利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
全内反射荧光显微镜介绍
评价
棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。
目前使用CCD 探测,
全内反射荧光显微镜利用消逝波照
可达到的量子产率
射样品并使其成像成为可能，也成 就了其高信噪比。
已到～80 % ,成像
速率～200 全内反射荧光显微镜介绍 Hz.
全内反射显微镜的分型及其结构
▪ 全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型
两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
全内反射荧光显微镜 的基本原理
全内反射荧光显微镜介绍
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
荧光激发原理
全内反射荧光显微术是利用全内反射产生的消逝波 激发样品,从而使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受 到激发,荧光成像的信噪比大大提高。可以看到样品表面， 单分子的活动情况。这种方法的成像装置简单，极易和其 它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm 甚至更低的空全间内分反射辨荧率光显。微镜介绍
物镜型全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜介绍
05级医学实验 宋一萌
全内反射荧光显微镜介绍
• 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生
的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。
• 当今世界上研究单分子科学最具前途的新
90年代
20 新型物镜透镜、聚光 世 镜和超灵敏探测器的 纪 出现，使TRIFM技术
得到充分发展。
80年代早期
Axelrod等生物物理
20学家对TRIFM技术 世 及基本原理进行描 纪 述，并探索了其生
物应用。
全内反射荧光显微镜介绍
1965年
Hirsch field
完成了 第一个 全内反射 荧光实验
荧光激发原理
snell定律:
n1sin θ1=n2 sin θ2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射荧光显微镜介绍
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
荧光激发原理
非均匀波
沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数全衰内反减射荧。光显微镜介绍
表示未被激发的荧光分子。
CCD相机的快速成像特点提 高了其时间分辨率，使得观察单分 子的运动、细胞物质的分泌、蛋白 质的相互作用成为可能并成为这方 面的优势观察仪器。
wenku.baidu.comCCD相机
当对活细胞 成像时,为了 达到单分子 级的灵敏度 或是为了减 少曝光时间, 需要采用图 像增强器。
CCD相机的高灵敏度特点使
1995年
1996年
Yanagida小
Moerner小组
组用TIRFM技
又用这项技术
术首次在液体 这是首实次现尝了试限用制全在内反射荧光
溶液中得到了 法测液丙体烯中酰的胺单胶个体分子的荧光。
荧光标记的单 将全反的射纳理米论孔与中生的物细胞的荧
个蛋白质分子 的成像。
光的突成破像单成。技分像术子。相的结三合维是一种全新
▪ NA = nsin（u/2） ▪ nsin（u/2） > nsinθc ▪ NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的
折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全 反射的临界角。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
二者比较
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
棱镜型全内反 射荧光显微镜
隐失波的强度-深度图
荧光激发原理
T12（θi）- 分界面处的透射强度 θi - 入射角 d 12 - 渗透深度 λ - 入射光波长
透射强度和浸透深度公全内反式射荧光显微镜介绍
对于可见光波长 380 ～ 780nm而言，
浸透深度为～ 100nm。
箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。 黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点 全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
发展历史
全内反射荧光显微术的发展历程
在细胞生物学方面，传统光学显微镜始终不能解决生物样本显 微中的几个重要问题：
1.显微图像的信噪比不高； 2.光源对生物样本照射的损伤； 3.光学衍射所致的分辨极限（R ≥0. 61λ/nsinθ）：
传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响, 存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsin(u/2) ,其中R为分辨 力 ,λ为成像光波波长, nsin(u/2)为物透镜的数值孔径,即NA 值，u为 孔径角,因此光学显微镜空间全内分反射辨荧极光显限微镜～介2绍50 nm。
全内反射荧光显微术的发展历程
近年来人们开发出了一系列光学显微镜。 其中，全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy ,TIRFM)是 近年来新兴的一种光学成像技术。
全内反射荧光显微镜介绍
肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生， 荧光标记驱动蛋白动态研究。
在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。
放置样品的空间受到棱镜的限制。
全内反射荧光显微镜介绍
（二）物镜型全内反射显微镜
收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜
发生全内反射的光学器件。
全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜介绍
▪ 由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 , 因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为：
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜介绍
发展与展望
优势应用
分型及结构
基本原理
发展历史
全内反射荧光显微镜介绍
发展历史
荧光显微镜的概念
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。