6.种子的扩大培养

生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
从种子罐接种
第三节
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
种子制备过程举例
斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养 →发酵
制备过程
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子
1.斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2.大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）。
培养条件：25℃、7天，控制湿度。 培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面 积 和氧的传质，营养适当（要求大米的白 点 小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子。
3、起始接种物的传代问题 细菌 保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面 目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。 子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月.
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代 不超过3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
第六章
种子扩大培养
1.种子扩大培养的目的与要求 2.种子制备的技术概要 3.种子制备实例
第一节
种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念：
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶 及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过 程,这些纯种培养物称为种子。
确定种子罐级数需注意的问题：
–种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会； –种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生 产率，增加染菌机会； –虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选 用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发 芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基.
种子的质量要求： 108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
活力旺盛
采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东， 发酵科技通讯，2003,7
背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的1%左右）
二级种子大种量（种子罐是发酵罐的5%以上）
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%.
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时.
对于产孢子的微生物
获得一定数量和质量的孢子 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。 获得一定数量和质量的菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。
2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较 小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都 比较精细。
种子扩培的目的： 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
无杂菌污染
保持稳定的生产能力
第二节
一、种子制备的过程
种子制备的技术概要
实验室阶段：
不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备， 在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培 养过程称为实验室阶段的种子培养。
种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大， 但是最终由实验结果定。
6、种子的质量要求： 量：要求达到一定的浓度； 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH、 酶活等。 无污染。
7.种子质量的判断
pH； 菌种的数量；
注：汉生罐是酵母扩大培养中的一个培养罐
2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和 质量有较大的影响。
3）pH： 主要是H＋对微生物生命活动的影响。
4）通气量与搅拌：
微生物不同阶段对氧的需求是不同的，通常在种子扩培过程中， 前期需氧量大，后期较小。搅拌有利于传质，传氧。但不可过于剧 烈。 例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种 情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。 但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有 利。
（2）培养条件
1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。主要影响 酶反应和生命运动。如土霉素生产菌种在高于37˚C培养时， 孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝 过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢 子斜面的培养温度。
啤酒扩大培养： 试管（28℃） －→小罐（25℃） －→ 汉生罐（13～15℃） －→一级，二级 －→发酵罐（10℃）
文章：三级种子工艺
斜面→一级种子（1200ml/5000ml三角瓶）→二级种子（2m3）
→三级种子（20m3)→发酵（240m3)
培养基成分表
用途 保藏 成分（%）
牛肉膏 （英国） 1，蛋白胨（日本），琼脂粉（日 本）1.8， 无机盐 添加 0.1的口服葡萄糖，其余同上
规模
斜面
一级 二级
口服葡萄糖 3， 玉米浆 2.4，尿素 0.65，无机盐 1200 ml 等 /5000 ml 玉米淀粉双酶糖 2.0， 玉米浆 2.0 1.0, 尿素 0.35， 无机盐等 ，甘蔗糖蜜 1.2 / 2 m3
4、接种量的确定 移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为715%，但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 P 147
5、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或 发酵罐时的培养时间。
7.种子质量的控制措施
菌种稳定性的检查
将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养 皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落 接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。
杂菌检查
显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿 上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检 。
工艺
三级种子 二级种子
8小时产酸 （%）
2.2～2.7 1.0～1.5
12小时产酸 （%）
4.6～5.2 2.6～3.4
发酵周期 （h)
32 35
② 糖酸转化率高且稳定:
工艺 三级种子 产酸（%） 10.93 糖酸转化率 （%） 59.8 单罐产量 (吨） 21
二级种子
9.8
58
18
二、青霉素生产的种子制备
发酵级数确定的依据 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
种子罐级数取决于： ①种子的性质（生长繁殖性能）； ②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； ③孢子发芽及菌丝繁殖速度； ④发酵罐中种子的最低接种量； ⑤种子罐与发酵罐的容积比。
培养基灭菌前后磷、糖、氨基氮的含量；
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）； 其他参数，如接前抗生素含量、某种酶活力等。
种子异常分析
菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团
菌丝粘壁
8.影响种子质量的因素
原料质量和培养基 培养条件 斜面冷藏时间 染菌
（1）原材料质量与培养基
2%
薯干粉
成分
斜面
种子罐
发酵
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
麦汁
10% 0.5% 2% 22-28%
3、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工 厂从第一级种子罐开始计算发酵级数. 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵
一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的： 获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养 要比发酵培养基丰富。
三级
发酵
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐等
12 / 20 m3
154 / 240 m3
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
种子的质量要求： 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期 合成青霉素的能力最强。