枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验

化学与生命科学学院

摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

实验材料和方法

一、实验材料：

（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）

（二）培养基：

1、种子培养液

葡萄糖1%

Tryptone(胰蛋白胨)：1%,

Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,

NaCl(氯化钠)：1%

调pH7.2

若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液

玉米粉2 .0 %

黄豆饼粉1 .5%

CaCl 2 0 .02 %

MgSO4 0 .02%

NaCl 0 .25%

K2HPO4 0 .2%

柠檬酸钠0 .2%

硫酸铵0 .075%

Na2HPO4 0 .2 %

调节pH 值7 .0

（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）

（四）实验仪器

离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管

二、实验

1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备

–A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

–B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（100KPa 20min ）。

–C. 在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃120r／min振荡培养16h作种子

液。（6瓶/组）

3、发酵培养

–按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。

–在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。

40-48h酶活降低后结束实验。

三、α淀粉酶活性测定

（1）上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。

（2）吸取0.1mL标准糊精溶液，转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中，以此作为比色的标准。

（3）在比色管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。

（4）定时（~15s）取出0.1mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反应终点，记录时间t

四、计算酶活

计算淀粉酶活力

酶活力(U/mL) =(60/t×20×2%×n)÷0.5

•式中t为反应时间（分），

•n为酶液稀释倍数，

•0.5是使用的酶液量（mL），

•20是可溶性淀粉溶液体积ml

五、溶液配制

碘原液：

– 1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml，贮于棕色瓶中；

0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）

–称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正其pH至6.0。

比色用标准碘液：

–取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中；2%可溶淀粉：

–称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL 沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至

透明（约20min），冷却后加水定容至100ml。（当天配制）。

标准糊精溶液

–称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷

却后加水定容到100ml

结果

α-淀粉酶产生的时间

在上述培养条件下，12小时之前蛋白酶活力较低，36小时达到高峰，继续培养至60小

时，酶活逐渐下降，结果见表1。

表α-淀粉酶活力与培养时间的关系

.

α-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强，进入对数期后，酶活显著提高。

培养至36小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达

到高峰。

参考文献

1.唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53

62-5363,5371

2. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化[J]. 食品与生物技术学报, 1984, (02)