PCR技术克隆目的基因全过程

实验：目得基因克隆（PＣR技术)

【课前预习】

ＰCR（ｐoｌｙmeｒase chain rｅactｉon) 反应得基本原理.

【目得要求】

1.学习与掌握PCR 反应得基本原理与实验技术方法.

2.认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象与结果并加以分析与总结。

【基本原理】

类似于DＮA 得天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物.PCR 由变性－-退火-—延伸三个基本反应步骤构成:①模板DＮA得变性：模板DNA 经加热至９３℃左右一定时间后，使模板DＮA双链或经PCR扩增形成得双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;②模板DNＡ与引物得退火(复性)：模板DＮA 经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DＮA单链得互补序列配对结合;③引物得延伸:DＮA 模板——引物结合物在TaqDNＡ聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板ＤＮA 链互补得半保留复制链重复循环变性—－退火—-延伸三过程，就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板.每完成一个循环需2～4 分钟,２~３小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Ｐlatｅａｕ)所需循环次数取决于样品中模板得拷贝。

【实验用品】

１.材料:重组质粒DNA作为模板

2．器材与仪器：移液器及吸头，硅烷化得PＣR 小管，DＮA扩增仪（PE 公司）,琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪）,台式高速离心机

３。试剂:

①１0×PＣR 反应缓冲液:5０0mmol/L KCl，100mmoｌ/ＬＴris·Cl，在25℃下, ｐH9、0，1、0% Triton X-１00.

②ＭgCl２：２5mmｏｌ/L.

③４种dNＴP 混合物：每种2、5mmol/L。

④TaｑDNA聚合酶5U/μｌ。

⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：

【方法步骤】

（一）PCＲ反应

1、依次混匀下列试剂３５μl H2 O5μｌ1０×PCＲ反应缓冲液4μl 2５mｍoｌ/L ＭｇCｌ2 4μｌ４种dNTP ０、5μl 上游引物（引物1)0、5μｌ下游引物（引物2) 0、5μl 模板ＤＮＡ(约１nｇ）混匀后离心5秒。

2、将混合物在９4℃下加热５分钟后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入ＴａｑDNA聚合酶（0、5μｌ约2、5U)，混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上.

３、用９4℃变性1分钟,45℃退火1分钟，7２℃延伸２分钟,循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温１0分钟，使反应产物扩增充分。

4 电泳按前所述,取1０μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度. [注意]

1、PCR非常灵敏，操作应尽可能在无菌操作台中进行。

2、吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂.

３、加试剂前, 应短促离心10秒钟,然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上得试剂污染吸头侧面。

4、应设含除模板ＤNＡ所有其它成分得负对照。

【实验结果】

【注意事项】

微量操作、PＣR 反应体系得设计、引物设计、扩增条件得优化

【思考题】

１、降低退火温度对反应有何影响?

2、延长变性时间对反应有何影响？

３、循环次数就是否越多越好？为何？

4、ＰＣR有哪些用途?举例说明.

附：PCＲ知识(供参考）

(一）PCR 反应体系与反应条件

标准得ＰCR 反应体系:

１0×扩增缓冲液10ul

4 种ｄNＴP 混合物各２00ｕmol／L

引物各10~100pmｏl

模板ＤＮＡ０、１～２ｕg

Taq DNA聚合酶2、5ｕ

Mｇ２＋1、5mmoｌ/L

加双或三蒸水至１0０ul

PCR 反应五要素:参加PＣＲ反应得物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板与Mg2＋引物：引物就是PCR 特异性反应得关键,ＰCＲ产物得特异性取决于引物与模板DNA互补得程度.理论上，只要知道任何一段模板ＤNA序列，就能按其设计互补得寡核苷酸链做引物,利用ＰＣR就可将模板ＤNA在体外大量扩增。

设计引物应遵循以下原则：

①引物长度: 15-30bp,常用为２0bp左右。

②引物扩增跨度：以200—50０bp为宜，特定条件下可扩增长至10ｋb 得片段。

③引物碱基:G＋C含量以４0—６０%为宜,Ｇ+Ｃ太少扩增效果不佳，G＋Ｃ过多易出

现非特异条带。A TGＣ最好随机分布,避免５个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列。

④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3’端得互补,否则会形成引

物二聚体，产生非特异得扩增条带。

⑤引物3’端得碱基，特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对，以避免因末端碱

基不配对而导致PＣR 失败.

⑥引物中有或能加上合适得酶切位点,被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点,这对酶切分

析或分子克隆很有好处.

⑦引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性.

引物量：每条引物得浓度0、1~1umol 或１0～100ｐmｏl,以最低引物量产生所需要得结果为好，引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体得机会。酶及其浓度:目前有两种Taq ＤNA聚合酶供应，一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶，另一种为大肠菌合成得基因工程酶。催化一典型得PCR反应约需酶量2、5U(指总反应体积为1０0uｌ时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP 得质量与浓度：dＮTＰ得质量与浓度与PCR 扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后,