兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文

学号：08109117

常州大学

硕士学位论文

兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸

研究生孙晓慧

指导教师王利群副教授

学科、专业名称有机化学

研究方向生物有机化学

2010年 3 月

Improved Streptococcus Zooepidemicu s For Producing Hyaluronic Acid By Fermentation

A Dissertation Submitted to

Changzhou University

By

Sun Xiao-Hui

Organic Chemistry

Dissertation Supervisor: Prof. Wang Li-Qun

March，2011

常州大学学位论文原创性声明

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中文摘要

透明质酸(hyaluronic acid, HA)是由(β-1,4)-D-葡糖醛酸-(β-1,3)-N-乙酰-D-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物。HA因其专门的生物功能学、独特的流体力学特性和极强的持水保湿性，广泛应用于医药、化妆品、食品等领域。本研究旨在筛选HA产生菌株，通过多种诱变育种的方法提高透明质酸的产量，并建立发酵液透明质酸含量的快速检测方法，对改良后菌种的培养条件进行优化，最后对菌种的透明质酸合成酶基因进行克隆和序列分析，为通过基因工程技术手段提高菌种HA产量打下基础。

从160份牛鼻粘膜中成功筛选到一株野生型产透明质酸菌株。样品经梯度稀释后涂布血琼脂平板，观看菌落的形态特征和溶血特征，筛选到一株有荚膜的乙型溶血链球菌。将该菌株的发酵液多糖精提物和HA标准样的红外谱图进行对比，特征汲取峰的位置和形状差不多相同，峰的相对强度相似，讲明该菌株为产HA菌株。

对透明质酸含量检测方法CTAB比浊法和Bitter-Muir法进行优化和比较，并用于发酵液中透明质酸含量的检测，成功建立了一种更快速、更精确、更准确、更高效的透明质酸检测方法。线性回归方程为y=0.0071x-0.1018，R=0.99987。

以筛选到的菌株为动身菌株，通过紫外诱变得到溶血突变型菌株UV1。以突变菌株作为动身菌株进行NTG、微波复合诱变，筛选出一株HA产量明显提高的菌株W2，产量达到1.446 g/L，同时遗传稳定性优良。对突变菌株的摇瓶发酵条件进行了初步优化，确定了最佳发酵条件为：温度35 ℃，初始pH值8.0，装液量50 mL / 250 mL，

转速180 r/min，发酵时刻20 h时，HA产量达到1.86 g/L，比初始条件下提高了29%。在发酵过程中添加脯氨酸和葡萄糖酸钠能够提高HA产量，发酵10 h时添加1 g/L的脯氨酸，HA的产量提高至1.986 g/L；发酵12 h时加入12.5 g/L葡萄糖酸钠作为补充碳源，HA的产量提高至2.267 g/L。

从筛选到的产透明质酸原始菌株中获得其基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增获得透明质酸合酶基因has A序列，用限制性内切酶EcoR I和BamH I对目的基因和质粒pET-22b进行双酶切，然后将目的基因与质粒pET-22b进行连接，转入E. coli DH5α，得到转化子pET-22b-hasA，对转化子插入片段进行核酸序列分析，并与基因库中has A基因序列进行比对，为进一步通过基因工程手段改良菌种打下了良好的基础。

关键词：透明质酸；筛选；诱变；发酵；基因工程

ABSTRACT

Hyaluronic acid is a linear macromolecular polymer which is comprised of alternated disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl glucosamine by β-1, 3 and β-1, 4 glycosidic bonds. Depending on its special physiological characters, unique hydromechanical properties and excellent ability of holding water, HA is widely used in the fields of pharmacy, cosmetics and food etc. The purpose of this study was to screen HA- producing strain, to enhance the yield of HA through mutation breeding, to establish a rapid method to analyze the concentration of hyaluronic acid in fermentation broth, to optimize the fermentation conditions of improved strain, and to clone and analyze the hyaluronidase A gene (has A) sequence which is helpful to improve HA yeild by genetic engineering.

One strain of hyaluronic acid-producing bacteria was islolated successfully from 160 collected cattle tunica mucosa samples. Samples were coated on blood agar flat plates after gradient dilution, a strain of β-hemolytic streptococcus with capsule was identified by observation of morphplogical and hemolytic properties of colonies on the plates.The infrared spectroscopy of hyaluronic acid standard and fermentation broth extract of the screened bacterium was compared, and the size, shape and relative intensity of their typical IR peaks are similar. These results demonstrated that the β-hemolytic streptococcus produces HA.