多倍体啤酒酵母URA3基因的失活与恢复

基金项目：食品微生物基因组改造（国家863计划）（SS2012AA022108）；酿酒原料高效安全制造技术研究（“十二五”农村领域国家科技计划课题子课

题，2013AA102108）；天津科技大学校基金项目（20120114）。

收稿日期：,013-12-26

作者简介：许海艳(1989-),女,山东人,硕士研究生,主要从事酿酒酵母工业应用方面的研究,E -mail:gxqshaiyan@https://www.360docs.net/doc/a31162848.html, 三通讯作者：肖冬光,E-mail:xdg@https://www.360docs.net/doc/a31162848.html, 三

优先数字出版时间：2014-06-11；地址：https://www.360docs.net/doc/a31162848.html,/kcms/detail/52.1051.TS.20140611.1614.003.html 三

多倍体啤酒酵母URA3基因的失活与恢复

许海艳1，赵丽彬1，

董健1，肖冬光1

(天津科技大学生物工程学院,天津300457)

摘

要：以多倍体啤酒酵母菌株S6作为出发菌株，利用同源重组的方法构建了尿嘧啶营养缺陷型啤酒酵母菌株

S6-?U ，使之用于遗传标记，并把缺陷型菌株恢复成原营养型S6'。同时对出发菌株S6，缺陷型菌株S6-?U 和恢复后的菌株S6'的生长状况进行比较。结果表明，URA3点突变并没有弱化菌株的生长状况。从而建立一种快速获得缺陷型啤酒酵母菌株的方法。

关键词：微生物；啤酒酵母；多倍体；URA3；失活；恢复；啤酒中图分类号：TS261.1；TS261.5；TS261.4；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286(2014)08-0024-03

Inactivation and Recovery of URA3Gene of Polyploid Brewer's Yeas t

XU Haiyan,ZHAO Libin,DONG Jian and XIAO Dongguang

(College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China )

Abstract :Polyploid brewer's yeast strain S6was used as the starting strain to construct uracil auxotrophic strain S6-?U through gene homologous recombination,which could be used as a genetic marker.Then uracil auxotrophic strain S6-?U was restored to original strain and named strain S6'.The growth of strain S6,strain S6-?U and strain S6'was compared and the results suggested that the mutation of URA3gene would not re-duce the growth of the strain.Accordingly,a method for rapid preparation of auxotrophic brewer's strains had been established in this study.Key words :microbe;brewer's yeast ；polyploid ；URA3；inactivation ；recovery;beer

啤酒酵母是啤酒工业的灵魂,它的优劣直接影响着

啤酒质量[1]三啤酒酵母菌株基因背景复杂,一般为多倍体,而且很难产生孢子或不能产生孢子三研究表明,啤酒酵母菌株同源重组的效率较低[2],因此,增加了啤酒酵母菌株分子改造的难度三而采用常规的诱变育种技术很难获得理想的优良啤酒酵母菌株三因此,缺陷型作为筛选标记用于啤酒酵母的分子改造,相对于抗性标记基因不产生应用的安全性问题,对优良的啤酒酵母工程菌的选育具有重要的理论价值和应用前景三

在Saccharomyces cerevisiae 中,URA3基因能够编码乳清苷5-磷酸脱羧酶,该酶是尿嘧啶合成的关键酶[3]三该酶又可以将5-氟乳清酸(5-FOA)转化成有毒物质[4]三因此,具有点突变的URA3基因的菌株不能使5-氟乳清酸(5-FOA)形成有毒物质5-氟尿嘧啶核苷酸,从而对5-FOA 具有抗性,其尿嘧啶核苷酸营养则可以通过向培养基加入尿嘧啶来补充；而5-FOA 可以抑制野生型啤酒酵母菌生长[3]三因此5-FOA 可用于尿嘧啶营养缺陷型突变

体的筛选三

到目前为止,啤酒酵母菌株分子改造多以抗性基因作为筛选标记三然而,这种方法由于外源基因的引入存在应用的安全性问题,不易被大众接受三本文以多倍体啤酒酵母菌株S6作为出发菌株,将包含点突变的URA3基因ORF 的片段转入S6中,同源重组后获得了尿嘧啶缺陷型菌株S6-?U ,然后将其恢复成原营养型S6',并比较了它们的生长状况三整个过程完全不引入外源基因,不产生应用的安全性问题三1材料与方法

1.1

材料、

试剂及仪器菌种：实验室保存的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae )W303-1A (MATa leu2-3,112ura3-1trp1-1his3-1,15ade2-1)；下面发酵啤酒酵母菌株S6(Saccha -romyces carlsbergensis ),在其基础上进行URA3基因突变失活得到尿嘧啶缺陷型菌株S6-?U 三