试剂间的交叉污染

全自动生化分析仪及测定试剂盒目前已在各医院检验科大量应用，但在检测病人标本时，由于存在试剂间的化学污染，检测结果的可靠性受到一定程度的影响[1-4]，这一点目前并未得到生化检验人员足够的重视。出现问题时，往往未能追究原因，以避免相似问题的再发生。本文结合实际，探讨试剂间化学交叉污染的来源及如何避免的对策，希望引起检验人员重视，以减少此类污染带来的结果准确性问题。

一、试剂间化学污染的来源

临床实验室

全自动生化分析仪发展迅速，具有多项目、多样本的处理能力，检测速度不断提高，但由于共用吸样针、试剂针、搅拌棒以及比色杯，当生化仪长期使用致其清洗能力下降、比色杯老化后引起吸附力增加、生化仪内污垢的积聚、测试顺序安排不当，且常规清洗不能有效消除交叉污染时，就会增加试剂间化学污染的可能性，引起测定结果偏高或偏低。

1．试剂针污染：目前大多数全自动生化分析仪采用双试剂检测样本，试剂R1、R2的吸取与吐出，一般分别只配有一套试剂针。当试剂针在清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂可能会对下一相邻检测项目的检测结果造成影响。

2．搅拌棒污染：在试剂与样本混合后，往往需要用搅拌棒加以混匀，而搅拌棒若清洗不完全，或黏附力增加时，残留试剂及样品就会对下一相邻检测项目的检测结果造成影响。

3．比色杯污染：生化分析仪的比色杯一般是循环使用的，每个比色杯检测完毕后，进行清洗，然后继续下一个检测项目的检测。当某个比色杯清洗不完全时，吸附在比色杯上的上一个项目的残留试剂，可能会对在这个比色杯中进行的下一个项目的检测结果造成影响。

以上3种可能的污染，以比色杯污染最为严重，因为比色杯最难以清洗干净，且在实际工作中难以判断该比色杯上一测试的项目；试剂针吸量较大，亦难以清洗干净。

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二、试剂间化学污染的类型

临床实验室

试剂间化学污染的原因很多，常见的类型主要有以下几种：

1．试剂成分的直接污染：上一个测定试剂中含有下一个测试所要测定的物质，直接干扰下一检测的测定结果。如：淀粉酶（AMY）试剂中含有较高浓度的钙（Ca2+）；碱性磷酸酶（ALP）（IFCC法）、肌酸激酶（CK）（NAC法）、肌酸激酶-MB（CK-MB）（NAC法）、二氧化碳（CO2）（PEPC法）、AMY（EPS法）、三酰甘油（TG）等试剂中含有镁（Mg2+）；葡萄糖（GLU）（氧化酶法）、总蛋白（TP）与酸性磷酸酶（ACP）试剂中含有较高浓度的钾（K+）；

胆碱酯酶（ChE）、总胆固醇（CHOL）、GLU (GOD法)、尿酸（UA）(尿酸酶法)、乳酸脱氢酶（LD）(IFCC法)、羟丁酸脱氢酶（HBDH）(DGKC法)等试剂中可能含有磷酸缓冲液；CHOL、TG 试剂及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂中可能含有胆酸钠；丙氨酸氨基转移酶（ALT）(IFCC 法)、天冬氨酸氨基转移酶（AST）(IFCC法)试剂中含有高活性的LD；以上试剂的交叉污染就分别会对Ca2+、Mg2+、K+（紫外酶法）、磷（P）、总胆汁酸（TBA）及LD的测定结果造成干扰。

2．试剂成分参与反应：上一个试剂中含有的某种试剂成分与下一反应所要测定的底物有作用，因而干扰下一反应的测定结果。如：(1)Mg2+测定试剂的络合剂亦能与铁（Fe）结合，影响铁与铁络合剂的结合；(2)直接胆红素（DBil）（重氮法）试剂含有EDTA，Mg2+试剂中含有EGTA，均能与Ca结合，从而影响Ca的测定；(3)以甘油作为酶保护剂的试剂，会对TG的测定带来干扰；(4)钙（MTB法）试剂对K+有负干扰；(5)CHOL试剂中含有胆固醇酯酶，可水解胆固醇酯形成游离胆固醇，而引起对游离胆固醇测定的干扰。

3．反应进程相同：上一个试剂所引导的反应对下一个项目的反应进程带来间接的干扰，下一项目所测定的是前后两个项目反应的综合作用结果。如：(1)当上一反应产物为H2O2时，则对以Trinder反应产生颜色的测定结果引起干扰。如UA对CHOL结果的影响；CHOL 对肌酐（CREA）（酶法）测定结果的影响；GLU（氧化酶法）对CREA（酶法）测定结果的影响。(2)CK(NAC法)、CK-MB(NAC法)试剂中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU 的己糖激酶（HK）反应过程，因此可能对GLU的测定带来干扰，尤其对GLU的HK法测定可能带来严重干扰。

4．影响反应条件：影响下一个项目的反应条件如pH等，从而改变反应速率。如：(1)DBil （钒酸盐氧化法）试剂中含有表面活性剂的酒石酸盐缓冲液会影响ALT活性，对测定结果有负干扰。(2)CREA（苦味酸速率法）反应条件为碱性，果糖胺（动力学法）反应条件为酸性，受到污染后反应速率会减慢。(3)CREA（酶法）试剂中含有抗坏血酸氧化酶，影响了氧化还原反应的进程，会对TBA（酶循环法）测定结果有影响。

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三、试剂间化学污染的判别临床实验室

由于试剂中化学成分非常复杂，各种稳定剂、反应物质、缓冲体系共存，且各品种、各厂商的试剂内含物均不同，因此试剂间的化学污染往往较难判别。日常工作中往往是仪器评估没问题，而用户使用时存有污染；质控品和Westgard法则不起作用，质控往往在控；污染具有偶然性，并不是每次都出现[5]。这就导致了判别此类污染的困难性。

当按照日常的分析顺序出现异常结果时，将出现异常结果的分析项目及其前一个项目单独复检又恢复正常，多是由于发生试剂间交叉污染所致。但由于试剂成分的复杂多样性，仪器状况的独特性，可能发生的试剂间交叉污染的情况不尽相同。各个公司所提供的产品说明书常不能够全

面反映试剂组成的情况，因此需要通过试验才能发现试剂交叉污染可能带来的干扰。一般可以用以下试验来加以判别。临床实验室

1．将某一试剂作为样本进行全套项目测定，观察各项生化结果的情况，进而确定发生试剂交叉污染时造成直接干扰的项目。

2．1份样品分成2份，1份加生理盐水或其他适当的稀释液，另一份加等量的某试剂，同时测定，观察结果的变化，进而确定可能发生试剂交叉污染时造成干扰的项目。

3．试剂交叉污染实验方法：(1)交叉污染初试：假设有3个项目A，B，C，以一混合血清作为标本，按以下顺序测试：A，A，A，A，A，B，A，C，A，B，B，B，B，B，C，B，C，C，C，C，C。得到的结果分别为：A1，A2，A3，A4，A5，BA-B，AB-A，CA-C，AC-A，B1，B2，B3，B4，B5，CB-C，BC-B，C1，C2，C3，C4，C5（AB-A：表示B项目对A项目污染时A项目的测定值，其余表示类同）。以A2～A5、B2～B5、C2～C5的4次测定平均值分别作为A、B、C项目无污染时的测定值。若（AB-A/A×100％）＜95%或＞105%则强烈支持B试剂对A有交叉污染。(2)疑似污染确认：若上述初试结果B对A有污染，则可进行以下试验进行确认。测定顺序为：B，A，A，A，结果为：B，A1，A2，A3。若（A1/A3×100%）＜95%或＞105%，则强烈支持B对A有交叉污染。A1→A3的结果可观察受B污染的程度是否逐渐减轻。

四、消除试剂间化学污染的方法

1．要求检验人员对仪器工作流程、试剂组成、测定原理要了如指掌，对试剂交叉污染的各种可能性加以考虑，合理设计程序。更换试剂时，应仔细研究说明书，发现和避免可能存在的试剂交叉污染。

2．当发现有交叉污染时，应对仪器进行保养，如更换比色皿、管道，用无水乙醇擦洗试剂针和搅拌棒，检查清洗装置及效果等。

3．合理安排检测项目的顺序，在有交叉污染的检测项目中间插入一个或两个非污染项目[6-8]。最彻底的做法则是将被干扰项目置于干扰项目之前，以消除干扰发生的可能。由于各厂商试剂盒原理不同，内含成分不同，故无固定的测定顺序格式，需要自己摸索。一般检测顺序有以下原则：①不受上一试剂的干扰；②不影响下一试剂测定；③不影响测试速度；④充分运用剩余试剂位开展新项目；⑤利用好仪器的功能。

4．当合理设置测试顺序无法消除交叉污染时，可使用生化分析仪的试剂针、比色杯清洗程序，对试剂针、比色杯进行2次或多次清洗。用碱性清洗液及酸性清洗液冲洗试剂针可以有效地避免携带污染。

5．选用具有抗交叉污染的试剂盒：如在游离胆固醇试剂中添加胆固醇酯酶抑制剂，以减少胆固醇酯酶水解胆固醇酯而引起对游离胆固醇测定的污染。

实际工作中，用全自动生化分析仪进行连续的多个项目的测定，每个反应的详细过程难以探知，特别是比色杯的交叉污染无明显的特征，因此应理论分析结合实际应用摸索出一套符合本单位工作的方法。