枯草芽孢杆菌讲解学习
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7
枯草芽孢杆菌的转化
枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方 式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将 通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。 这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的 拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如 通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想 遗传平台。
枯草芽孢杆菌
Bacillus Subtilis
陈家馨 王玲玲 沈嘉妮
目
录
Contents
1
介绍枯草芽孢杆菌
2 为什么选择枯草芽孢杆菌
3 建立beadzillus开发Sporo beads
4
Sporo beads是什么
5
Sporo beads的应用
2
枯草芽孢杆
菌
枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。
因为易在枯草浸液中繁殖，所以人
5
模式生物需要满足的条件
01
易于培养和进行 遗传操作
02
标准化质粒原件 和相应的基因改
造方法
03
安全性
6
枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌
迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌 是一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳 性菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰 氏阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴 性菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。
10
载体的整合机制
它们都通过在特定位点的双重同源
重组插入到基因组中。因此，枯草
芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以
通过特定的检测来选择。
11
启动子的评估方式
01
发光测量
02
β-半乳糖苷酶 测定
12
三组启动子的评估
一，安德森系列启动子评估它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启 动子，并显示相对较弱的活性。
13
三，诱导性芽胞杆菌启动子 启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR -P XYL。一种新的抗生 素诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系 统LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动 时，表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具 有非常低的基础活性。用不同浓度的杆菌肽测量诱导，证明在大范围的启动子活性中具有浓度依赖性反 应。
们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性
菌，菌落表面粗糙不透明，污白色
或微黄色，在液体培养基中生长时，
常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白
质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形
成吲哚。
3
பைடு நூலகம்
枯草芽孢杆菌的生命周期和不同的细胞阶段。
枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生 的内生孢子。在我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用 于功能性融合蛋白的。
14
芽孢杆菌通讯员的选择
萤火虫萤光素酶是迄今为止最常用的生物发光通讯员。天然萤火虫荧光素酶作为遗传报告基因的普及 是由于酶测定的灵敏度和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合。由luc基因编码的萤火虫荧光 素酶是不需要任何翻译后修饰的单体; 它可以作为成熟酶直接在其mRNA翻译中获得。从核糖体释放后 立即获得催化能力。此外，荧光素酶在细胞中的半衰期非常短（约3小时）。综合起来，这些性质使 荧光素酶成为一个非常敏感的通讯员，远远超过其他常用的通讯员。
8
9
创建B 4 - 22核心部分
引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新底盘是此项目的主要目标。
B4-22核心部分包含以下芽孢杆菌的特定部分 Vertors（载体） promoters（启动子） reporters（通讯员） affinity tags（亲和标签） 我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。
二，组成型芽孢杆菌启动子 构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子 高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强 的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。 P XYL - xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以 评价活性。
15
16
bead zillus：为基本生物砖枯草芽孢杆菌和孢子的蛋白质展示的 平台
我们选择使用枯草芽孢杆菌来设计新的视野，并为这种模型生物提供工具，用于大肠杆菌 的iGEM世界。因此，我们在BioBrick标准中创建了由定义的启动子以及报告基因，表达和 空载体组成的芽孢杆菌 B io B rick B ox（B 4—22）。枯草芽孢杆菌天然产生耐应力的 内生孢子，其可以根据合适的环境条件发芽。为了突出使用这种独特的功能，我们开发 Sporo beads。这些是表面融合蛋白的孢子。我们将GFP（绿色荧光蛋白）融合到最外层。 扩大这个想法，我们设计了一个孢粉矢量可以轻松地创建任何孢粉珠。为了保证孢粉珠的 安全，我们通过敲除基因参与防止发芽，并制定了自杀开关在发芽的情况下接通。随着项 目Bead zillus，我们的团队展示了枯草芽孢杆菌的强大性质。
营养周期与大肠杆菌非常相似。然而，在 诸如饥饿等压力源的情况下，细胞进入孢 子形成，首先进行极细胞分裂，然后形成 内生孢子。如果环境条件再次合适，则孢 子会发芽并重新进入营养循环。
4
芽孢杆菌的分化
枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环 境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾 的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可 以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应对 环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助其 鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。 如果条件对于生存来说太糟糕了， 枯草芽孢杆菌可 以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段， 耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好 在枯草芽孢杆菌群落中区分不同细胞类型的示意图 的条件，他们才能再次发芽。
枯草芽孢杆菌的转化
枯草芽孢杆菌可以复制大肠杆菌的质粒，但是有一种更优雅的方 式引入外源DNA片段。当侧面与枯草芽孢杆菌基因组同源时，将 通过在该基因座处的同源重组以高效率整合，随后用染色体复制。 这导致稳定的单拷贝基因组改变，从而避免使用复制质粒发生的 拷贝数伪影。这种不同的基因操作的方式需要使用整合载体，如 通过我们提供B4-22。因此，枯草芽孢杆菌是合成生物学的理想 遗传平台。
枯草芽孢杆菌
Bacillus Subtilis
陈家馨 王玲玲 沈嘉妮
目
录
Contents
1
介绍枯草芽孢杆菌
2 为什么选择枯草芽孢杆菌
3 建立beadzillus开发Sporo beads
4
Sporo beads是什么
5
Sporo beads的应用
2
枯草芽孢杆
菌
枯草芽孢杆菌，芽孢杆菌属的一种。
因为易在枯草浸液中繁殖，所以人
5
模式生物需要满足的条件
01
易于培养和进行 遗传操作
02
标准化质粒原件 和相应的基因改
造方法
03
安全性
6
枯草芽孢杆菌革兰氏阳性菌
迄今为止大部分的合成生物学操作都是基于大肠杆菌（Escherichia coli）的，大肠杆菌 是一种革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌具有革兰氏阴性菌不具有的一些优势，比如：革兰氏阳 性菌有天然的外源基因摄入和整合入基因组的机制，这种机制为遗传操作提供了方便；革兰 氏阳性菌的分泌机制比较完善，蛋白质表达后可以很好地分泌到细胞外，而这正是革兰氏阴 性菌在异源蛋白表达时面临的最大问题。
10
载体的整合机制
它们都通过在特定位点的双重同源
重组插入到基因组中。因此，枯草
芽孢杆菌中的靶基因被破坏，可以
通过特定的检测来选择。
11
启动子的评估方式
01
发光测量
02
β-半乳糖苷酶 测定
12
三组启动子的评估
一，安德森系列启动子评估它们已经在大肠杆菌中被广泛测量，在枯草芽孢杆菌中测定了11只安德森启 动子，并显示相对较弱的活性。
13
三，诱导性芽胞杆菌启动子 启动子的最后一组包括来自两个诱导型启动子的枯草芽孢杆菌，P LIAI和xylR -P XYL。一种新的抗生 素诱导的启动子P lial其响应于干扰细胞壁的完整性和生物合成的抗生素。在刺激的情况下，双组分系 统LiaRS被激活。活化的响应调节剂LiaR与启动子的操纵子结合并诱导ia基因座的转录。当启动子启动 时，表达了两种蛋白质LiaI和LiaH。该启动子的主要优点是在不存在诱导物及其高动态范围的情况下具 有非常低的基础活性。用不同浓度的杆菌肽测量诱导，证明在大范围的启动子活性中具有浓度依赖性反 应。
们取名枯草芽孢杆菌。革兰氏阳性
菌，菌落表面粗糙不透明，污白色
或微黄色，在液体培养基中生长时，
常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白
质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形
成吲哚。
3
பைடு நூலகம்
枯草芽孢杆菌的生命周期和不同的细胞阶段。
枯草芽孢杆菌能够分化成具有不同形态和功能的细胞。最特征的形式是在营养不足的情况下产生 的内生孢子。在我们的项目中，我们利用了内生孢子的生产。因为它们是极其稳定的，孢子是用 于功能性融合蛋白的。
14
芽孢杆菌通讯员的选择
萤火虫萤光素酶是迄今为止最常用的生物发光通讯员。天然萤火虫荧光素酶作为遗传报告基因的普及 是由于酶测定的灵敏度和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合。由luc基因编码的萤火虫荧光 素酶是不需要任何翻译后修饰的单体; 它可以作为成熟酶直接在其mRNA翻译中获得。从核糖体释放后 立即获得催化能力。此外，荧光素酶在细胞中的半衰期非常短（约3小时）。综合起来，这些性质使 荧光素酶成为一个非常敏感的通讯员，远远超过其他常用的通讯员。
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创建B 4 - 22核心部分
引入枯草芽孢杆菌作为基于BioBrick的合成生物学的新底盘是此项目的主要目标。
B4-22核心部分包含以下芽孢杆菌的特定部分 Vertors（载体） promoters（启动子） reporters（通讯员） affinity tags（亲和标签） 我们所有的标签都是由GeneArt合成的。我们的亲和标签还未验证。
二，组成型芽孢杆菌启动子 构建了三种新的枯草芽孢杆菌启动子（P liaG，P veg，P lepA）PliaG该启动子显示比Anderson启动子 高得多的活性，但与其他评估的芽孢杆菌启动子相比仍然相对较弱。Pveg这个推动者是我们评估中最强 的。PlepA该启动子的活性在最强的芽孢杆菌启动子P veg的活性和弱P liaG之间。 P XYL - xylR是从木糖诱导启动子枯草芽孢杆菌。对于这种启动子，我们尚未成功克隆到报告载体中以 评价活性。
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bead zillus：为基本生物砖枯草芽孢杆菌和孢子的蛋白质展示的 平台
我们选择使用枯草芽孢杆菌来设计新的视野，并为这种模型生物提供工具，用于大肠杆菌 的iGEM世界。因此，我们在BioBrick标准中创建了由定义的启动子以及报告基因，表达和 空载体组成的芽孢杆菌 B io B rick B ox（B 4—22）。枯草芽孢杆菌天然产生耐应力的 内生孢子，其可以根据合适的环境条件发芽。为了突出使用这种独特的功能，我们开发 Sporo beads。这些是表面融合蛋白的孢子。我们将GFP（绿色荧光蛋白）融合到最外层。 扩大这个想法，我们设计了一个孢粉矢量可以轻松地创建任何孢粉珠。为了保证孢粉珠的 安全，我们通过敲除基因参与防止发芽，并制定了自杀开关在发芽的情况下接通。随着项 目Bead zillus，我们的团队展示了枯草芽孢杆菌的强大性质。
营养周期与大肠杆菌非常相似。然而，在 诸如饥饿等压力源的情况下，细胞进入孢 子形成，首先进行极细胞分裂，然后形成 内生孢子。如果环境条件再次合适，则孢 子会发芽并重新进入营养循环。
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芽孢杆菌的分化
枯草芽孢杆菌的自然栖息地是土壤，被迫适应许多环 境变化。因此，枯草芽孢杆菌的特征在于快速和狡猾 的反射和复杂的生活方式。由于其天然的能力，它可 以占据外源DNA并将其整合到其基因组中。灵活应对 环境，转向营养或避免有毒物质，它的活动是借助其 鞭毛。如果饥饿，一些细胞甚至成为食人兄弟姐妹。 如果条件对于生存来说太糟糕了， 枯草芽孢杆菌可 以形成内生孢子。这些是非常休眠和高度稳定的阶段， 耐干燥，紫外线，热和压力。一旦这些孢子遇到更好 在枯草芽孢杆菌群落中区分不同细胞类型的示意图 的条件，他们才能再次发芽。