【CN109504799A】一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法【专利】
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种快速鉴定镰刀菌菌种的 引物组合 ，包括选自 第一 引物组 、第二 引物组中 的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组 中的至少一种，其中第一引物组由SEQ ID NO .1 和SEQ ID NO .2所示的序列组成，第二引物组由 SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .3所示的序列组成，第 三引物组由SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示的 序列组成，第四引物组由SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .6所示的序列组成。本发明的引物组合重复性 好 ，特异性高 。本发明 还公开了利 用上述 引物组 合鉴定镰刀菌菌种的方法 ，准确性高 ，操作简单 ， 适用于镰刀菌菌种的快速鉴定。
(74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通 合伙) 43205
代理人 舒欣
(51)Int .Cl . C12Q 1/6895(2018 .01) C12Q 1/6869(2018 .01) C12Q 1/04(2006 .01) C12N 15/11(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一 种快 速鉴定 镰 刀菌菌 种的 引物组 合 及方
(10)申请公布号 CN 109504799 A (43)申请公布日 2019.03.22
权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图1页
CN 109504799 A
CN 109504799 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引 物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，
所述第一引物组包括具有SEQ ID NO .1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQ ID NO .2所示核苷酸序列的下游引物TEF-2R；
所述第二引物组包括具有SEQ ID NO .1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQ ID NO .3所示核苷酸序列的下游引物TEF-3R；
2 .根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、 第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。
3 .根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、 第二引物组中的一种，和选自第三引物组、第四引物组中的一种。
4 .一种快速鉴定镰刀菌菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤： 获取待鉴定镰刀菌的基因组DNA； 以所述DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增； 将扩增产物进行凝胶电泳检测，并将目标PCR产物进行测序； 将测序结果通过BLAST比对， 如果测序结果的 序列与参考镰刀菌的 相似性超过90％ ，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀 菌属于同一种。 5 .根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二 引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。 6 .根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二 引物组中的一种，和选自第三引物组、第四引物组中的一种。 7 .根据权利要求6所述的方法，其特征在于，如果测序结果中的至少一个序列与参考镰 刀菌的相似性不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。 8 .根据权利要求7所述的方法，其特征在于，如果测序结果中的两个序列均与参考镰刀 菌的相似性不低于98％，则待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。 9 .根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于，其中PCR扩增的体系为：总体积50μ L：含Mg2+的5×PCR Buffer10μL，10mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下 游引物1μL，5U/μL KD酶1μL，DNA模板50ng，ddH2O补至50μL。 10 .根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于，其中PCR扩增的程序为：94℃预变 性2min；94℃变性30s，60℃复性40s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910062676 .6
(22)申请日 2019 .01 .23
(71)申请人 上海市农业科学院 地址 201403 上海市奉贤区金齐路1000号
(72)发明人 王建华 刘玉洋 张静雅 赵志勇 杨俊花 杨宪立
2
CN 109504799 A
说 明 书
1/8 页
一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法
Hale Waihona Puke Baidu
技术领域 [0001] 本发明属于分子生物学实验技术领域，具体地，涉及一种快速鉴定镰刀菌菌种的 引物组合及方法。
背景技术 [0002] 镰刀菌(Fusarium spp .)在无性时期属于半知菌亚门，有性时期属于子囊菌亚门。 目前 ，已 发现的 镰刀菌不 少于44种。镰刀菌属于兼寄生或腐生生活 ，在全世界分布广泛 ，可 动植物有机体上生长，会引起植物的根、茎和花等组织的腐烂，严重影响了粮食、经济作物 以及药用植物的产量和品质，具有较高的危害性。 [0003] 镰刀菌属是真菌中较大的一个属，为丝状真菌，广泛分布于自然界中。镰刀菌可以 侵染多种植物，如粮食作物、油料作物、经济作物等，造成严重的产量损失。镰刀菌及其引起 的 病害防 控一直是国内外的 研究热点。随 着全球气候的 变化及耕作制度的改 变 ，频繁的国 际贸易活动、适宜的温湿度、广泛的传播途径和有利的寄主等使得镰刀菌迅速地跨地区传 播 ，镰刀菌的 种群结构在全球范围内发生了显著变化。镰刀菌种类鉴定是开展其生物多样 性研究、病害防控及植物检验检疫等工作的基础，开发镰刀菌鉴定新方法是目前的迫切需 求。 [0004] 由于镰刀菌种类多，分布广，传统的形态学分类方法很难准确对其进行鉴定，利用 分子生物学的 技术 ，从分子层面对镰刀菌进行鉴定 ，不仅速度快 ，而且鉴定结果准 确 ，为镰 刀菌的 分 类 研究 提 供 有效 方 法 。不同 种类 镰 刀菌 翻译 延 伸因 子 基因 (t ra n s la ti o n elongation factor 1α，TEF)具有高度的保守性，TEF基因测序比对分析能准确鉴定镰刀 菌 ，目 前已 建 立 了 专门 的 镰 刀 菌 T E F 基 因 序 列 数 据 库 。以 前 有 研 究 者 基 于 里氏 木 霉 (Trichoderma reesei) 和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的TEF基因序列 (GenBank检索号分别为Z23012和U14100)设计了用于扩增丝状真菌TEF基因的简并引物对： EF-1(5 '-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3 ')和EF-2(5 '-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT3 ') (O 'Donnell K .,Kistler H .C .,Cigelnik E .,Ploetz R .Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana:concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies .PNAS ,1998 ,95:2044-2049，在此全 文引入作为参考) ，该引物对在大多数丝状真菌鉴定中起到很好的作用。但是，利用引物对 EF-1/2进行镰刀菌基因组扩增时经常出现扩增失败或有杂带的情况，说明该引物对的使用 具有一定的局限性，可能对某些菌种不适用。值得注意的是，引物对EF-1/2是根据里氏木霉 (Trichoderma reesei)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的基因序列设计开 发的 ，引物设计的位置可能在镰刀菌基因组中是不保守的。
所述第三引物组包括具有SEQ ID NO .4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQ ID NO .5所示核苷酸序列的下游引物EF-LR1；
所述第四引物组包括具有SEQ ID NO .4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQ ID NO .6所示核苷酸序列的下游引物EF-LR2。
本发明公开了一种快速鉴定镰刀菌菌种的 引物组合 ，包括选自 第一 引物组 、第二 引物组中 的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组 中的至少一种，其中第一引物组由SEQ ID NO .1 和SEQ ID NO .2所示的序列组成，第二引物组由 SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .3所示的序列组成，第 三引物组由SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .5所示的 序列组成，第四引物组由SEQ ID NO .4和SEQ ID NO .6所示的序列组成。本发明的引物组合重复性 好 ，特异性高 。本发明 还公开了利 用上述 引物组 合鉴定镰刀菌菌种的方法 ，准确性高 ，操作简单 ， 适用于镰刀菌菌种的快速鉴定。
(74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通 合伙) 43205
代理人 舒欣
(51)Int .Cl . C12Q 1/6895(2018 .01) C12Q 1/6869(2018 .01) C12Q 1/04(2006 .01) C12N 15/11(2006 .01)
( 54 )发明 名称 一 种快 速鉴定 镰 刀菌菌 种的 引物组 合 及方
(10)申请公布号 CN 109504799 A (43)申请公布日 2019.03.22
权利要求书1页 说明书8页 序列表4页 附图1页
CN 109504799 A
CN 109504799 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引 物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，
所述第一引物组包括具有SEQ ID NO .1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQ ID NO .2所示核苷酸序列的下游引物TEF-2R；
所述第二引物组包括具有SEQ ID NO .1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQ ID NO .3所示核苷酸序列的下游引物TEF-3R；
2 .根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、 第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。
3 .根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、 第二引物组中的一种，和选自第三引物组、第四引物组中的一种。
4 .一种快速鉴定镰刀菌菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤： 获取待鉴定镰刀菌的基因组DNA； 以所述DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增； 将扩增产物进行凝胶电泳检测，并将目标PCR产物进行测序； 将测序结果通过BLAST比对， 如果测序结果的 序列与参考镰刀菌的 相似性超过90％ ，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀 菌属于同一种。 5 .根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二 引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。 6 .根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二 引物组中的一种，和选自第三引物组、第四引物组中的一种。 7 .根据权利要求6所述的方法，其特征在于，如果测序结果中的至少一个序列与参考镰 刀菌的相似性不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。 8 .根据权利要求7所述的方法，其特征在于，如果测序结果中的两个序列均与参考镰刀 菌的相似性不低于98％，则待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。 9 .根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于，其中PCR扩增的体系为：总体积50μ L：含Mg2+的5×PCR Buffer10μL，10mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下 游引物1μL，5U/μL KD酶1μL，DNA模板50ng，ddH2O补至50μL。 10 .根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于，其中PCR扩增的程序为：94℃预变 性2min；94℃变性30s，60℃复性40s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸5min。
( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910062676 .6
(22)申请日 2019 .01 .23
(71)申请人 上海市农业科学院 地址 201403 上海市奉贤区金齐路1000号
(72)发明人 王建华 刘玉洋 张静雅 赵志勇 杨俊花 杨宪立
2
CN 109504799 A
说 明 书
1/8 页
一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法
Hale Waihona Puke Baidu
技术领域 [0001] 本发明属于分子生物学实验技术领域，具体地，涉及一种快速鉴定镰刀菌菌种的 引物组合及方法。
背景技术 [0002] 镰刀菌(Fusarium spp .)在无性时期属于半知菌亚门，有性时期属于子囊菌亚门。 目前 ，已 发现的 镰刀菌不 少于44种。镰刀菌属于兼寄生或腐生生活 ，在全世界分布广泛 ，可 动植物有机体上生长，会引起植物的根、茎和花等组织的腐烂，严重影响了粮食、经济作物 以及药用植物的产量和品质，具有较高的危害性。 [0003] 镰刀菌属是真菌中较大的一个属，为丝状真菌，广泛分布于自然界中。镰刀菌可以 侵染多种植物，如粮食作物、油料作物、经济作物等，造成严重的产量损失。镰刀菌及其引起 的 病害防 控一直是国内外的 研究热点。随 着全球气候的 变化及耕作制度的改 变 ，频繁的国 际贸易活动、适宜的温湿度、广泛的传播途径和有利的寄主等使得镰刀菌迅速地跨地区传 播 ，镰刀菌的 种群结构在全球范围内发生了显著变化。镰刀菌种类鉴定是开展其生物多样 性研究、病害防控及植物检验检疫等工作的基础，开发镰刀菌鉴定新方法是目前的迫切需 求。 [0004] 由于镰刀菌种类多，分布广，传统的形态学分类方法很难准确对其进行鉴定，利用 分子生物学的 技术 ，从分子层面对镰刀菌进行鉴定 ，不仅速度快 ，而且鉴定结果准 确 ，为镰 刀菌的 分 类 研究 提 供 有效 方 法 。不同 种类 镰 刀菌 翻译 延 伸因 子 基因 (t ra n s la ti o n elongation factor 1α，TEF)具有高度的保守性，TEF基因测序比对分析能准确鉴定镰刀 菌 ，目 前已 建 立 了 专门 的 镰 刀 菌 T E F 基 因 序 列 数 据 库 。以 前 有 研 究 者 基 于 里氏 木 霉 (Trichoderma reesei) 和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的TEF基因序列 (GenBank检索号分别为Z23012和U14100)设计了用于扩增丝状真菌TEF基因的简并引物对： EF-1(5 '-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3 ')和EF-2(5 '-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT3 ') (O 'Donnell K .,Kistler H .C .,Cigelnik E .,Ploetz R .Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana:concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies .PNAS ,1998 ,95:2044-2049，在此全 文引入作为参考) ，该引物对在大多数丝状真菌鉴定中起到很好的作用。但是，利用引物对 EF-1/2进行镰刀菌基因组扩增时经常出现扩增失败或有杂带的情况，说明该引物对的使用 具有一定的局限性，可能对某些菌种不适用。值得注意的是，引物对EF-1/2是根据里氏木霉 (Trichoderma reesei)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)的基因序列设计开 发的 ，引物设计的位置可能在镰刀菌基因组中是不保守的。
所述第三引物组包括具有SEQ ID NO .4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQ ID NO .5所示核苷酸序列的下游引物EF-LR1；
所述第四引物组包括具有SEQ ID NO .4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQ ID NO .6所示核苷酸序列的下游引物EF-LR2。