细菌诱发气孔开度变化的检测

一、 实验目的和要求 1．掌握从蚕豆叶片撕取下表皮用于研究气孔运动的技术 2. 掌握气孔开度的基本测量方法 二、 实验内容和原理 1.气孔(stomata)是位于植物地上部分表皮上的一种特化的细胞器，由一对保卫细胞环绕而成。气孔形态分为肾形和哑铃型两种。本实验的蚕豆叶是肾形细胞。哑铃型多为禾本科植物。 气孔能够响应外源刺激并自主调控自身开度，主要刺激有： （1） 光照的刺激，光会使气孔打开 （2） 植物激素的刺激，如脱落酸使气孔关闭 （3） 外界co2的浓度变化，外界co2浓度高，则气孔打开

（4） 生物刺激见下文

由于气孔是叶际病原细菌入侵宿主的主要门户，“外源细菌无法像真菌一样穿过植物表皮，故只能通过天然孔道如气孔或植物伤口进入”。

Melotto 用丁香假单胞菌番茄致病变种(P. syringaepv. tomato strain DC3000, PstDC3000)接种拟南芥叶片, 发现接种1 h 后气孔关闭, 3~4 h 后气孔重新打开, 而用非致病性大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7, E. coil O157:H7)接种时不能使关闭的气孔重新打开。随后的研究表明, Pst DC3000重新打开气孔的能力是依赖于COR 。

同时，进一步的研究表明叶表面的微生物不仅可诱发其直接作用的气孔的免疫性闭合, 而且可引起接种点周围3~20 mm 半径范围内气孔的群体性关闭行为,微生物引起气孔关闭的现象大大降低了病菌通过气孔进入宿主植物的概率。由此可见, 作为植物先天免疫的重要环节, 气孔在抵御细菌入侵方面发挥着积极主动的作用。

但植物表皮对细菌因子的此种响应可以被其他环境因子所抵消，如低CO 2浓度、黑暗、

干燥甚至植物激素ABA 1。

3. 气孔开度（Stomatal aperture ）的直接测量和间接测量

直接测量——直接在显微镜下用目镜刻度线进行观测测量气孔最宽处的读数，并记录。 间接测量——通过植物的温度变化来显示植物的气孔开度，用红外线图来显示植物的温度。

本实验采用直接测量发，测量光学显微镜下组成气孔的两个保卫细胞相互靠近侧外壁的横向最大距离。以40*10下显微镜的标尺最小格数为一个测量单位，来显示不同条件下气孔的开放程度。

三、 实验材料与用品

实验材料：新鲜的蚕豆叶片

实验用品：显微镜、镊子、单面刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸、目镜测微尺 实验试剂：MES/KCl 缓冲液，溶液A ，溶液B

装

订

线

四、实验步骤

•在三个培养皿中各加入9 mL的MES/KCl缓冲液

•撕取蚕豆叶片下表皮放入培养皿中（5个表皮条/培养皿），光照培养1 h

•随后分别在三个培养皿中各加入1 mL的MES/KCl缓冲液、A溶液和B溶液，继续光照培养0.5 h（每5分钟搅动一次培养溶液）

•制片、气孔开度测量（每组3人，每人各测一个处理）

蚕豆叶片下表皮的剥取操作：

•选取叶龄4周的完全展开的蚕豆叶片

•用刀片除去叶尖和叶基

•沿中叶脉将叶片剪为两半，在叶端斜切小口

•用尖头镊子夹取叶端小口，均匀用力，撕取下表皮条，快速转移至MES缓冲液中

六、实验结果与分析：

加入B溶液后气孔开度的均值小于对照组，加入A溶液后气孔开度比B组更低。故推测A溶液为较浓菌液，B溶液为较稀菌液。

由此可以看出，植物气孔在遇到外界细菌入侵时，的确会使气孔关闭来抵御外界细菌的入侵。