第四章 (一) 色谱法概述

(a) 柱内谱带构型； (b) 相应的响应信号。
续
Dg与流动相及组分性质有关（柱温；柱压等）： (a) 扩散导致色谱峰变宽，H↑( n↓)，分离变差; (b) 分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩 散↑; -1/2 (c) 扩散系数：Dg ∝（M载气） ； M载气↑，B 值↓。
第四章 （一）色谱法概述
一、概述
俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置 ，如右图。
☆ 色谱法是一种分离技术；
☆ 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称 之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过 程。
☆ 其中的一相固定不动，称为固定相；
☆ 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（ 气体或液体），称为流动相。
第三 n 与半峰宽度及峰底宽的关系式为：
tR 2 tR 2 n 5.54 ( ) 16 ( ) Y1/ 2 Y
式中 tR 与 Y1/2( 或 Y) 应采用同一单位 ( 时 间或距离).可以看出，在tR一定时，如 果色谱峰越窄，则说明 n 越大， H 越 小．柱效能越高。
续
在实际工作中，常用有效塔板数n有效表示柱效：
续
B H A C u u
式中H ：理论塔板高度， u 为流动相的线速度；A，B, C为 常数，分别代表了涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质
阻力项系数。
（1）改变A、B、C 三项可提高柱效； （2）存在着最佳流速；
（3）A、B、C 三项各与哪些因素有关？
（1）涡流扩散项 A
在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由 于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中 形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。
用Gauss正态分布函数表示:
1 t tr 2 c exp[ ( ) ] 2 2 c0
C: 不同时间 t 时某物质的浓度； C0: 进样浓度；tr: 对应于浓度峰 值的保留时间；σ: 标准偏差。
续
1. 基线 ：无试样通过检测 器时，检测到的信号即 为基线。
2. 保留值 (1) 时间表示的保留值: 保留时间（t R）：组分从进样到柱后出现 浓度极大值时所需的时间。 时 间 (t M): 不与固定相作用的气体（如空气）的保留 (2) 死 时间。 (3) 调整保留时间 (t R’): t R＇= t R-t M
t 'R 2 t 'R 2 n 5.54 ( ) 16 ( ) Y1/ 2 Y
因为在相同的条件下，对不同的物质计算所得的塔板数不一 样，因此，在说明柱效时，除色谱条件外，还应指出是用什 么物质来进行测量的。
（4）例题（理论塔板数的计算）
已知某组分峰的峰底宽40s，保留时间为400s， 计算此色谱柱的理论塔板数。 解：
r2 ,1
t ' r2 t ' r1

V ' r2 V ' r1
由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与 栓径、柱长、填充情况及流动相流速无关。因此， 它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作 定性的依据。
3. 区域宽度
色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡 量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区 域宽度通常有三种方法。
从色谱流出曲线中可得信息:
(i) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数； (ii) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； (iii) 据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； (iv) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依 据； (v) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(或流动相)选择是否合 适的依据。
三、色谱法基本原理
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离， 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数 决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离， 如果每个峰都很宽，以致彼此重叠、还是不能分开。这些峰的宽或窄是 由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质 有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。 下图是A、B 两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。图中KA ＞ KB，因此 A 组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两 峰间的距离逐渐变大，同时每一组分的浓度轮廓 ( 即区域宽度 ) 也慢慢变 宽。显然，区域扩宽对分离是不利的、但又是不可避免的。
(1) 标准偏差σ：即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。 (2) 半峰宽Y1/2：即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的 关系为: Y 1/2＝2.354σ. (3) 峰底宽度Y：即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间 的距离。它与标准偏差σ的关系是：Y = 4σ
从色谱流出曲线中，可得许多重要信息。
(e) 试样中的各组分具有不同的 K 值是分离的基础；某组分的K = 0 时， 即不被固定相保留，最先流出。
（2）分配比 k
分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两 相间分配达平衡时固定相和流动相中的质量比。即
溶质在固定相中的质量 ms k 溶质在流动相中的质量 m m
k 值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因 此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的 重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱 压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。
混合物样品 在色谱柱中 的分离情况
从不同角度，可将色谱法分类如下：
色谱法分类
流动相 固定相 液体 气体 固体 （ 吸附剂） 液体 吸附剂 键合 固定相 柱 柱 液体 固体 多孔 离子 固体 交换剂 柱 柱 超临界 流体 键合 固定相
固定相 外形
柱
柱
柱
平面
平面
柱 超临界流 体色谱
名称
气液 色谱
气固 色谱
若要使A、B两组分完全分离，必须满足以下三点：
续
第一，两组分的分配系数（即与固定相的结合能力）必须有 差异； 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度； 第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。 前两点是完成分离的必要条件。
1. 分配系数和分配比
（1）分配系数 K
分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间 反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次 地吸附 — 脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相 间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数 K 。 它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动向之间 分配达到平衡时的浓度之比值，即
（3）塔板理论结论
第一 当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板数n大于 50 时，可得到 基本对称的峰形曲线。在色谱柱中，n值—般是很大的，如气 3 6 相色谱柱的n约为 10 -10 。因而这时的流出曲线可趋近于正态 分布曲线。
第二 当试样进入色谱柱后，只要各组分在两相间的分配系数有微小 差异，经过反复多次的分配平衡后，仍可获得良好的分离。
(2) 分子扩散项 B／u (纵向扩散项)
纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从 柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。 如右图所示。它随着流动相向前推进，由于存在 浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散， 造成谱带展宽。分子扩散项系数为：
B＝2γDg
式中γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素, 也 称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对 自由分子扩散的阻碍情况,填充柱色谱, γ <1。 Dg 2 -1 为组分在流动相中扩散系数(cm · s )。
保留时间与死时间之比。即:
k = tr/tm
2.塔板理论
色谱柱长：L； 虚拟的塔板间距离：H；
色谱柱wk.baidu.com理论塔板数：n；
则三者的关系为：n = L / H
（1）理论假定
把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两 相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理 论假定： (i) 在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小 段柱称为理论塔板高度H。
(ii) 流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个 塔板体积(ΔVm)。 (iii) 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴(纵)向扩散可忽 略。 (iv) 分配系数在所有塔板上是常数。与组分在某一塔板上的量无关。
续
对一根长为 L 的色谱柱，溶质平衡的次数应为：
n=L / H n 称为理论塔板数。色谱柱的柱效随理论塔板数 n 的增加而增加，随板高 H 的增大而减小。
续
ms csVs k mm cmVm
式中Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相 的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类 型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体 积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。
可以证明： k 是组分的调整
由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱 柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不 一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：
续
A=2λd p L
A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子λ 有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了 减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且 填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流 扩散。因此 A＝0。
（2） 塔板分离示意
该组分的分布可计算如下：
为简单起见， (a) 设色谱柱由5块 塔板(n = 5, n 为为柱子的 塔板数)组成， 编号，分别 为 0 ， 1 ， 2，...，n-1。 (b) 某组分的分配 比k = 1.
续
（1）开始时，若有单位质量，即m=1(1mg或1ug)的该组分加到第 0号塔板上，分配达平衡后，由于k=1，即p = q,故p = q = 0.5. （ 2 ）当一个板体积 (1ΔV) 的淋洗液以脉动形式进入 0 号板时，就 将流动相中含有 q 部分组分的淋洗液顶到顶到 1 号板上，此 时 0 号板液相中 p 部分组分及 1 号板流动相中的 q 部分组分， 将各自在两相间重新分配，故0号板上所含组分总量为0.5， 其中流动相和固定相两相各为 0.25 ；而 1 号板上所含总量同 样为0.5，流动相和固定相两相亦各为0.25。以后每当一个新 的板体积流动相以脉动式进入色谱住时，上述过程就重复 一次，如上图所示。
液液 色谱
薄层色谱 纸色谱
液固 色谱
键合相 色谱
尺寸排 离子交 阻色谱 换色谱
二、 色谱流出曲线及其有关术语
由检测器输出的电信号强度对时 间作图，所得曲线称为色谱流出 曲线（见右图）。曲线上突起部 分就是色谱峰。
如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分 配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的，可
tR 2 400 2 n 16 ( ) 16 ( ) 1600 Y 40
3. 速率理论-影响柱效的因素
1956年荷兰学者范.弟姆特（Van Deemter）等在研 究气液流色谱时，提出了色谱过程动力学理论—速率理
论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了 组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上 较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、 液相色谱都适用，Van Deemter方程的数学简化式为：
溶质在固定相中的浓度 cs K 溶质在流动相中的浓度 cm
分配系数 K 的讨论
分配系数是由组分和固定相和流动相的热力学性质决定的，它是每 一个溶质的特征值。它仅与固定相和流动相的性质及温度有关 。与两相 体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。 (a) 一定温度下，组分的分配系数 K 越大，出峰越慢； (b) 试样一定时，K 主要取决于固定相性质； (c) 每个组份在各种固定相上的分配系数 K 不同； (d) 选择适宜的固定相可改善分离效果；
（2）用体积表示的保留值
保留体积（VR）：VR = tR×F0
F0 为洗脱液流速。单位： mL / min 。
死 体 积 （VM）： VM = tM ×F0
调整保留体积（VR＇）： V R＇ = VR －VM
续
(3) 相对保留值r 2,1 某组分 2 的调整保留值与组分 1 的调 整保留值之比．称为相对保留值。