根癌农杆菌介导的植物遗传转化1

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化

一实验目的

了解植物遗传转化的方法和理论

掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术

二原理

植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。

农杆菌介导法

土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化，磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。

三实验材料

烟草KRK26叶片，农杆菌菌株EHA105，质粒的T-DNA含目的基因GFP，卡那霉素抗性基因为选择标记基因，结构如下图所示:

LB Bt nos3 MCS

nos3 nptII nos5 RB

四器具和试剂

灭菌锅,天平,电炉,三角瓶,培养皿,封口膜,镊子,酒精灯,剪刀,琼脂, pH试纸滤纸, MS培养基母液(见表一), NAA,6-BA,蔗糖，葡萄糖, Parafilm, MGL活化培养基, LB培养基,卡那霉素,头孢霉素.氨苄霉素

五实验步骤与说明

1无菌苗的制备

无菌苗的制备按照实验一的方法进行

1农杆菌的活化

超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化，取少量接种至含kana的液体LB，28℃180rpm低速摇床震荡培养，约12-16h后LB浑浊，取大约700ul至含Kana的LB 平皿，涂布均匀，吹干后封口放置在28℃的暗培养箱，48-60h后农杆菌长满整个平皿，把培养基表面菌落刮入三角瓶内含AS（乙酰丁香酮）的MGL培养基中，28℃、180rpm 摇2hr，OD值在0.5-1.5之间即可用于侵染。

注意：从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱；农杆菌在LB平皿内保存时间不宜过长应尽量保持新鲜；用MGL培养基悬浮农杆菌时，某些菌株若出现结块，可在瓶内放入几根灭过菌的大头针，或者结合减少悬浮时间，在其结块前进行侵染。

1浸染，共培养：

取无菌培养的烟草健壮叶片，切除主茎脉及边缘后将剩余叶片切成长约0.5cm的小正方形，用镊子夹到经活化的菌液中，搅匀，侵染5-7min，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的共培养培养基(MS无机盐+B5有机物+6-BA1mg/l+NAA0.1mg/l+ Mgcl.6H2O 0.3 g/l+蔗糖25g/l+葡萄糖5g/l+ patal gel 2.6g/l, pH 5.85-5.90 )中，19-21℃, 暗培养48-60小时结束共培养。

注意：侵染时烟草叶片稍为干燥可以增加农杆菌的吸附；共培养过程中下胚轴上带过多的菌液容易导致下胚轴在共培养过程中受缺氧和毒害等不利环境条件而大量死亡，因此要通过控制共培养的时间和温度来控制农杆菌的过度生长.

1选择培养

把经过共培养的叶片连同滤纸一起取出浸入含1600mg/l头孢+ mg/l Amp的无菌水中，浸泡15-20 min，倒掉洗液，用无菌水清洗三遍，滤纸吸干水分，吹10分钟使表面稍为干燥；弱光培养；培养30天左右继代一次转入相同的选择培养基中(MS无机盐+B5有机物+6-BA1mg/l+NAA0.1mg/l+ Mgcl.6H2O 0.3 g/l+蔗糖25g/l+葡萄糖5g/l+卡那霉素75mg/l+头孢霉素400 mg/l +Phtagel2.6g/l, pH 5.85-5.90 )

注意：共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，可以减少农杆菌的污染.

1分化成苗

培养约20天后在叶片边缘开始长出幼芽，将幼芽切下继代培养至芽诱导培养基，待长至3-4

真叶时继代培养到生根培养基。

农杆菌转化烟草叶片技术流程如下

烟草无菌苗的制备农杆菌菌株培养活化

↘↙

烟草叶片小块与农杆菌共培养

↓48小时

用无菌水（含Cef+Amp）冲洗叶片小块

↓

将叶片接种于选择培养基中诱导芽

（含Kana和Cef）

↓

诱导出芽，继代至芽诱导培养基

↓

长出3-4片真叶后继代至生根培养基

↓

再生植株的成苗移栽

六实验结果与思考题

1.根癌农杆菌介到的棉花遗传转化的基本步骤有那些,有那些注意事项?

2.根癌农杆菌介到的棉花遗传转化中使用的共培养培养基和选择培养基的作用分别是什么?为什么要在共培培养基中加入乙酰丁香酮?

3.根癌农杆菌介导的植物遗传转化有那些优缺点?

4.那些措施可以提高根癌农杆菌介导的转化效率?

LB培养基配方

胰化蛋白胨10 g/L，

酵母提取物5 g/L，

氯化钠10 g/L，

PH值7.0

MGL液体培养基配方