大豆蛋白的提取和测定

生化自主实验

一、大豆蛋白的提取

目的要求

1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法

2 、计算粗提产率

2、学习计算蛋白质收率

实验原理

大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。

称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。

试剂和器材

1、试剂

（1）10%Nacl （2）0.2%NaoH

（3）75%乙醇（4）6mol/L HCL

（5）1mol/L HCL （6）1 mol/L NaoH

2、器材

（1）离心机（2）烧杯（3）滴管

（4）PH试纸等

操作方法

1、水抽提

将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min，3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。

其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和 1 mol/L HCL，调PH4.5~5.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。

蛋白质产物重量

蛋白质产率= --------------------------- ×100%

原料总重量

Folin酚法测定蛋白质含量

目的要求

掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法

实验原理

蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。其中双缩脲法和Folin 酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin 酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。

Folin酚法所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽链起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酷氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。

样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸的色氨酸的浓度。

Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。

试剂和器材

1、材料：

本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。

2、试剂：

（1）0.03mol/L PH7.8的磷酸缓冲液。

（2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。

（3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10g

NaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；

称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。

（4）Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。

上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH 溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin 乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。

3、器材：

试管10支、试管架一个、移液管、移液管架、洗瓶、恒温水浴、723型分光光度计

实验步骤

1、标准曲线的制作：

按表进行操作

2、样品测定：

取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲线（可取两支试管编号8、9，与工作曲线同时进行反应和比色测定）；

3.蛋白质浓度的计算：

A650值对应的mg数(Pr)

Pr(mg/ml)= ---------------------------------- ×稀释倍数

Pr溶液的ml数