异养微生物的分类和群落特征

异养微生物的分类和特征群落基础上的群落级别模式单一碳源的利用

以四氮唑还原染料为基础的BIOLOG还原技术是利用单一碳源作为指标，快速的群落级别的方法。用这种方法可以对异养微生物进行描述和分类。在包含95个独立碳源的完整的环境样品（水，土壤和根际）的BIOLOG板上直接培养出利用单一碳源并具有环境依赖性的生物模式。通过对BIOLOG板的数字化图像反应的颜色进行量化，就可以对主要成分进行分析。分析结果会显示土壤和河流内的微生物栖息地和空间梯度的不同。用这种方法对微生物群落进行密集的空间和时间分析可以产生生态相关的异养微生物群落类别。

White和Findlay已经开发出一种群落级别的方法，这个方法是通过评估整体环境样品中的脂肪酸甲基脂的变化，从而区分微生物群落的结构。该方法已经成功检测到总细菌、硅藻、厌氧硫酸盐还原细菌在各种微生物栖息地中的生物量的变化。这种方法消除了传统方法的不足，并增加了潜在的抽样范围。

以不同的碳源为基础的微生物群落结构实验需要对碳源的利用进行快速而多样的分析。BIOLOG公司最近开发了一个基于氧化还原的技术。这一技术是对用以菌种鉴定的细菌菌株进行碳源利用的测试。用四唑紫对菌株进行染色，各菌种的颜色不同是由于各个碳源中的微生物的呼吸不同。市售微孔板允许同时测试95个独立的碳源。直接将整个环境样本放于BIOLOG板上进行培养，从而可能会产生合适的代谢反应的模式用以快速对异养微生物群落进行分类。

选定培养期后，在BIOLOG板上反映出的颜色通过数字化图像进行量化。对多变量数据集（95种颜色反应）的主要成分分析可以区分出相对于微生物栖息地总规模的各种在此栖息地中的微生物的空间梯度的细微规模。

材料和规模

BIOLOG板。BIOLOG GN微孔板（BIOLOG有限公司）在本研究中所用的氧化还原燃料四氮唑紫来检测单一碳源中菌落的新陈代谢。96孔GN微孔板包含95个底物孔和一个控制孔。底物、燃料和营养物质经重新调配成样品放置于干燥薄膜中，然后供给每一个孔。

数据收集。取部分样品分别接种到盘上。接种一个盘大约需要17ml样品。

BIOLOG板的数字化图像时通过使用一个数字化视频扫描仪（Eikonix公司）得到的，然后使用ERDAS软件（ERDAS，公司）进行分析。此软件仅是作为地理信息系统使用，但由于它在阅读数字化图像方面具有灵活性，所以将它作为理想的选择。对每个像素的绿色扫描频带中的反射率被转换为表示相对强度的一个灰度等级值。用Turbo pasal这一计算机程序，对划分为3×3矩阵的孔进行像素采样。每个矩阵中的平均像素值作为各孔颜色反应的测量值。数据分析。BIOLOG板的整体颜色发展被表示为平均颜色。分别检测出95个反应孔（包含单一碳源）中颜色的灰度值R,以及一个控制格（未加碳源）中颜色的灰度值C，用公式[∑(C-R)]/95计算95个孔与控制孔的平均灰度差（称为原始差）。95个反应空的灰度值值应当比控制孔的空白灰度值低30至40色度单位。应当确定观察到控制孔的发色良好，计算得板上所有孔的原始差都应在标准范围内，这个标准范围应该是4至5个色度单位。

单一碳源利用率可以用两种方式表示：（ⅰ）原始差数据[C-R]( ⅱ)变换数据(C-R)/{ [∑(C-R)]/95}。这两种表达式都能产生一组含有95个变量的数据。原始差数据，每个样品每次读取时原始差的数据范围从0到大约130，并且后期培育大部分碳源利用率较高，因为随着时间的推移样品色产量增加。变换数据，计算出的数据值从0到大约4，如果数据值﹤1表明颜色反应少于平均颜色，如果﹥1则表明颜色反应大于平均颜色。

在电脑上使用PC-ORD软件包可以对原始差或者变换数据进行主要成分分析，从而确定各种不同样品之间的关系。

样品来源和编制。对三个完全不同的群落类型（样品类型）在BIOLOG板上进行了测试：（ⅰ）水样（包括淡水、河水、海水，以及用于种植小麦的培养液），（ⅱ）水培小麦的根际样品（耶克拉罗亚小麦品种），（ⅲ）土壤样品。

所有的水样直接用移液管移入BIOLOG微孔板中。淡水样品是1990年3月中旬取的，淡水样品取自绿色县的弗吉尼亚州兰多国家公园附近的一个分水岭的淡水池塘和溪流。这些样品都具有相似的PH值（6.3至7.0）、温度（7至12℃）、电导率（40至60）。河口和海水样品是1990年7月中旬取的，这些样品取自弗吉尼亚州的长期生态研究海岸保护区。

摇动由含有玻璃珠（直径为5mm）和小麦根际的无菌生理盐水溶液（0.85%NaCl），这样可以取的根际样本。在接种前用10微米孔隙直径的聚碳酸酯过滤器过滤掉植物细胞，取得悬浮液。

取三个土壤样品（表3）中的风干样品在稀介质中培养以制备没有受到土壤提取物颜色干扰的细胞悬浮液。为确定选择性富集的潜在影响，制备悬浮液用三种独立的稀介质：（ⅰ）0.0025％酵母提取物（YE培养基），（ⅱ）0.0025％酵母提取物和0.025％Bacto-胰蛋白胨（YP培养基），及（ⅲ）0.0025％酵母提取物和0.005％每个果糖，木糖，葡萄糖，乳糖，和甘露糖醇（YS 培养基）。使用旋转振荡器（型号G2；新不伦瑞克公司）在100rpm下震荡烧瓶，悬浮液置于震荡烧瓶中在25℃条件下培养18小时后悬浮液中的一些成分会被去除。这样避免了土壤部分的干扰。制备两个相同的悬浮液用以与每一种土壤介质相结合。

所有板置于25℃下，不加搅拌。当一些微孔中的样品呈现显著色彩时开始进行初次扫描，通常是20至40小时后。第二次扫描通常是16至24小时后。

结论