黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究

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黑曲霉ρ-葡萄糖甘酶的提纯与性质

黑曲霉ρ-葡萄糖甘酶的提纯与性质
宛晓春;汤坚;丁霄霖
【期刊名称】《菌物系统》
【年(卷),期】1998(17)2
【摘要】从黑曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｎｉｇｅｒ发酵液中分离提纯了β－葡萄糖苷酶。

提纯步骤通过（ＮＨ４）２ＳＯ４分级沉淀，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００等三步纯化，得到凝胶电泳均一的β－葡萄糖苷酶。

该酶的最适ｐＨ４．５，最适温度６０℃，Ｋｍ为０．４４（ＮＰＧ），并有较好的热稳定性。

【总页数】6页(P154-159)
【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;提纯;性质
【作者】宛晓春;汤坚;丁霄霖
【作者单位】安徽农业大学轻工业学院;无锡轻工大学
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.327.1
【相关文献】
1.黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀粉酶的提纯及其… [J], 管汉成;严自正
2.黑曲霉β—葡萄糖苷酶的提纯与性质 [J], 宛晓春;汤坚
3.葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的重组表达及酶学性质 [J], 林晓彤;潘力;罗时渝;王斌
4.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 郭金玲;陈程鹏;周一郎;陈红吉;吕育财;任立伟;龚大春
5.黑曲霉胞内β-葡萄糖苷酶分离提纯及其性质的研究 [J], 赵林果;夏文静;游丽金;王平;余世袁
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产柚苷酶黑曲霉SL2K发酵条件优化

产柚苷酶黑曲霉SL2K发酵条件优化伍玉春;陈显玲;苏龙【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)006【摘要】该研究以黑曲霉(Aspergillus niger) SL2K为研究对象,对其产柚苷酶的液态发酵条件进行优化.通过单因素试验对碳源、氮源、诱导物、接种量、初始pH 值和培养时间进行考查,在单因素基础上,选取麸皮粉添加量、蛋白胨添加量、接种量、初始pH值4个因素进行4水平正交试验优化.结果表明,优化后的产酶发酵条件为麸皮粉添加量3％,蛋白胨添加量5％,接种量8％,初始pH值为5.0,鼠李糖0.08％、KH2PO41 g/L,KO 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,FeSO40.01 g/L,装液量为100 mL/250 mL,摇床转速180 r/min,培养温度28℃,培养时间96 h.在此优化条件下,柚苷酶活力为233.89 U/mL,是优化前的2.13倍.【总页数】6页(P125-130)【作者】伍玉春;陈显玲;苏龙【作者单位】燕京啤酒(玉林)有限公司,广西玉林537000;燕京啤酒(玉林)有限公司,广西玉林537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西农产资源化学与生物技术重点实验室,广西玉林537000【正文语种】中文【中图分类】Q939.97【相关文献】1.黑曲霉TC-01产柚苷酶分离纯化及其降解内毒素研究初探 [J], 邓媛;毛勇;杨国武;李飞;李皎;张美丽;王燕2.黑曲霉固态发酵产柚苷酶培养基的优化 [J], 钱伟;黄元杰;王先锋;高乾坤;孟娜;魏胜华3.黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺优化及热激对提高酶活的影响 [J], 李坤峰; 孙西同; 李佥; 石峰; 徐杰; 罗健; 田晶; 费旭4.黑曲霉菌发酵产柚苷酶培养基配方的优化研究 [J], 张桃桃;张萍;石彦鹏;牛春5.响应面法优化超声强化黑曲霉发酵产柚苷酶的工艺 [J], 石峰;李佥;田晶;费旭;刘向丽;罗健;张楠;陈高俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究

柚子皮黑曲霉的分离鉴定及产酶特性研究张超凤;汪雨晨;陈卫平;张凤英【摘要】对柚子皮上自然生长的黑曲霉进行分离鉴定,并探讨其产酶特性.以平板稀释法从柚子皮上分离出一株霉菌菌株,通过观察其形态特征和培养特征,对照《真菌鉴定手册》判定该菌株的种属;采用鉴定培养基法对其产酶特性进行分析.根据柚子皮的成分特性,以干柚子皮为主要原料,该菌为生产菌株,采用固态发酵法探究培养基的成分、柚子皮含量、培养基初始含水量及发酵时间4个因素对纤维素酶活力的影响.结果表明,该菌株为黑曲霉(Aspergillus nige),可产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶;固态发酵培养基中添加柚子皮12g,麸皮0.5g和(NH4) 2SO40.5g,培养基初始含水量保持在68.5 mL/100 g,培养时间控制在60 h左右时纤维素酶产量较高.%Aspergillus niger naturally grow on pomelo peel was separated and characterized,and investigated for its enzyme-producing features.Plate dilution method was used to isolate a mold strain,and it was identified through observ ing its morphological and culture features,and compare to Fungi Characterization Handbook to judge the genus and species of the strain.The identification medium is adopted to discuss the enzyme production characteristics.Dried pomelo peels as major rawmaterial,according to the component feature of pomelo peel,and the strain as producing strain,adopting solid state fermentation method to investigate the effects on cellulase activity of four factors,component of culture medium,the content of pomelo peel,the initial water content of the medium,as well as fermentation time.The result showed that the strain was Aspergillus niger and it can produce fourenzymes:amylase,protease,cellulase and pectinase;12 g pomelo peels,0.5 g wheat bran,and 0.5 g (NH4)2SO4,and initial water content at about 68.5mL/100 g and fermentation time at about 60 h,the yield of cellulase was at the higher level..【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2017(037)003【总页数】6页(P22-27)【关键词】柚子皮;黑曲霉;固态发酵;纤维素酶【作者】张超凤;汪雨晨;陈卫平;张凤英【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌334450【正文语种】中文【中图分类】Q93-331黑曲霉(Aspergillus nige)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是一种常见的繁殖能力较强的真菌，且又是不产生毒素的安全菌种，因而被人类长期利用[1]。

黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产_葡萄糖苷酶的研究_刘小杰

黑曲霉ZJ1摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的研究刘小杰(浙江大学食品科学与营养系,杭州310029)陶飞　童纪峰(杭州娃哈哈集团有限公司科委,杭州310018)摘要:本文研究了黑曲霉ZJ1发酵产β-葡萄糖苷酶的发酵条件及β-葡萄糖苷酶的酶学性质。

结果表明:黑曲霉摇瓶发酵产β-葡萄糖苷酶的培养基组成为(g/L):稻草50,麦麸15,大麦粉15,(NH4)2SO410,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O0.5,起始pH5.0。

产酶条件为:培养温度28℃,转速为200r/min,当培养时间为144h,β-葡萄糖苷酶活性达到最大。

β-葡萄糖苷酶的最适作用温度为50℃,在40℃时热稳定性较好;β-葡萄糖苷酶的最适反应p H为5.5,在p H3.0～p H8.0之间较稳定;Zn2+、Al3+、Ca2+和Mn2+对β-葡萄糖苷酶酶促反应均有一定的促进作用。

关键词:黑曲霉,β-葡萄糖苷酶,稻草粉,发酵Study ofβ-Glucosidase Produced by As pe rgillus Niger ZJ1Liu Xiaojie(Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou310029)Liu Xiaojie,Tao F ei,Tong Jifeng(R&D Department of Hangzhou Wahaha Group Company Limited,Hangzhou310018)A bstract:This paper studied the fermentation condition and properties ofβ_glucosidase b y As pergillius niger.Experimental re-sults demonstrated that cultivation medium composition was as follows(g/L):rice straw powder50,wheat bran15,barley flour 15,(NH4)2SO410,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O0.5,initial pH5.0.The maximumβ_glucosidase activity reached at28℃with RPM of200r/min when cultured144hours.β_glucosidase's optimum temperature was50℃,and it was stable under40℃.Its optimu m p H was5.5and it was stable in p H3.0～pH8.0.Metal cation influence enzyme activity,Zn2+、Al3+、Ca2+and Mn2+have active effects on enzyme activity.Key words:As pergillius nig er,β_glucosidase,Straw powder,Fermentation 目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种,大多是里氏木霉(Trichoderma reesei)的优良突变株,虽然这些菌株能产生高活力的内切型及外切型葡聚糖酶,但不足之处在于β_葡萄糖苷酶产量很低。

c27黑曲霉培养及分离纯化

jjjjdj 黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。

黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。

黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。

顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。

孢子直径2.5～4.0μm。

分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。

黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。

二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。

3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。

三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。

注意，一定要卷紧。

1.2 试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。

1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。

注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。

上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。

1.4 高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查培养基配方：硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g 氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH5.0-6.02.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。

黑曲霉菌发酵产柚苷酶培养基配方的优化研究

黑曲霉菌发酵产柚苷酶培养基配方的优化研究作者：张桃桃张萍石彦鹏牛春来源：《安徽农业科学》2021年第07期摘要 [目的]筛选出黑曲霉菌发酵产柚苷酶的最优培养基。

[方法]以沙氏琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、察氏琼脂培养基作比较;选出最适黑曲霉菌生长的固体培养基，对固体培养基进行优化，得出最佳固体培养基;通过对发酵培养基不同碳源种类、氮源种类和无机盐的筛选和优化，确定黑曲霉生长和发酵的最适培养基，再通过正交试验确定黑曲霉固态发酵产柚苷酶最优培养基。

[结果]黑曲霉固态发酵产柚苷酶最优培养基组成为0.1%磷酸二氢钾，4%鼠李糖，1%葡萄糖，0.2%无水CaCl2，0.2%七水硫酸镁，0.1%硫酸铵，02%柚皮苷，2%豆粉。

优化后的培养基（618 U/g）比优化前的基础培养基（401 U/g）的酶活提高了54.1%。

[结论]该研究为后续进行菌种遗传改造与分子育种提供了原材料，并为大规模商业化生产奠定了良好的基础。

关键词黑曲霉;发酵培养基;单因素试验;正交试验中图分类号 TS201.3 文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）07-0170-04Abstract [Objective] To screen out the optimal medium for producing naringinase by Aspergillus niger fermentation.[Method] Sartre’s AGAR medium，potato glucose AGAR medium and Tsar AGAR medium were compared.The best solid medium for Aspergillus niger growth was selected and optimized to obtain the best solid medium.Through selection and optimization of different types of carbon source，nitrogen source and inorganic salts in the fermentation medium，to determine the optimal culture medium for growth and fermentation of Aspergillus niger，the optimum medium for producing naringinase by solid fermentation of Aspergillus niger was determined by orthogonal experiment.[Result]The optimal culture medium was： 0.1% potassium dihydrogen phosphate，4% sugar lee，1% glucose，0.2% anhydrous CaCl2，0.2% MgSO4 7H2O，0.1% ammonium sulfate，0.2% naringin，2% soybean meal.The enzyme activity of optimized medium （618 U/g） was 54.1% higher than the optimized base medium （401 U/g）.[Conclusion] It provided raw materials for genetic modification and molecular breeding，and laid a good foundation for largescale commercial production.Key words Aspergillus niger;Fermentation medium;Single factor test;Orthogonal test作者簡介张桃桃（1990—），女，宁夏银川人，助理工程师，从事生物制药研究。

黑曲霉TC-01产柚苷酶分离纯化及其降解内毒素研究初探

黑曲霉TC-01产柚苷酶分离纯化及其降解内毒素研究初探邓媛;毛勇;杨国武;李飞;李皎;张美丽;王燕【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2018(000)001【摘要】[目的]对黑曲霉TC-01产柚苷酶进行分离纯化及酶学性质研究,并对柚苷酶降解内毒素进行初步研究.[方法]黑曲霉TC-01发酵优化后的酶液经硫酸铵分级盐析、透析浓缩、DEAE Bio-Sep FF离子交换层析等分离纯化,考察酶学性质,初步研究柚苷酶对内毒素的降解作用.[结果]柚苷酶纯化后,比活力6429.3u/mg,纯化倍数31.1倍.酶学性质研究结果表明TC-01产柚苷酶最适pH4,最适温度60℃,考察金属离子对酶活影响,1 ～ 10mMCa2+、Mg2+对柚苷酶酶活有促进作用,Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+对柚苷酶的酶活有抑制作用,Fe2+抑制作用最为强烈.柚苷酶对内毒素具有降解作用,柚苷酶与内毒素反应1h,内毒素降解率达到79.9％.[结论]研究为柚苷酶的工业化生产提供理论依据,同时拓宽了柚苷酶的应用范围,为进一步研究柚苷酶降解内毒素提供了基础数据,具有重要的科学意义和应用价值.【总页数】7页(P80-86)【作者】邓媛;毛勇;杨国武;李飞;李皎;张美丽;王燕【作者单位】陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043;陕西省微生物研究所,西安710043【正文语种】中文【中图分类】Q815【相关文献】1.不同温度、pH和无机离子对黑曲霉A66菌株产柚苷酶活力影响的初步研究 [J], 张璟晶;袁敏;管远红;涂国全2.一株产柚苷酶菌株黑曲霉的分离及菌种鉴定的初步研究 [J], 赖崇德;蔡华静;夏海林;施孝活;刘金国;涂国全3.黑曲霉TC-01产柚苷酶对柚皮苷酶解作用的研究 [J], 邓媛;毛勇;王燕;李飞;张美丽;李皎4.黑曲霉产木聚糖酶的分离纯化与鉴定研究 [J], 高月淑;许敬亮;袁振宏;蒋剑春;何敏超;张宁5.黑曲霉菌发酵产柚苷酶培养基配方的优化研究 [J], 张桃桃;张萍;石彦鹏;牛春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柚苷酶生产菌TC-01发酵培养条件的优化及其酶学性质的初步研究

素试验优化碳、氮源对产酶的影响，利用ＰａｋｔＢｒａｌｃｅ— ｕｍｎ设计筛选影响产酶的主要因素，最后通过响应面分析法对ｔ液体发酵培养条件进行优化，优化后柚苷酶酶活与初始相比提高了２４倍，达到１２６／Ｌ－１．Ｕｍ。对Ｔ一１７ｃ０产柚苷酶中Ｏ一鼠李糖苷酶和１一ｔ３Ｄ葡萄糖苷酶的酶学性质分别进行了研究，２酶反应的最适反应温度均为６个０℃，在５０℃以下保温１ｈ，２个酶的活力基本不受损失；２个酶最适ｐＨ值为４０一鼠李糖苷酶在ｐ．，Ｈ值４０８．— ．０范围内稳定性较
柚苷酶生产菌Ｔ一１发酵培养条件的优化Ｃ０及其酶学性质的初步研究
邓媛，毛勇，张美丽，王燕，李飞，李皎
（陕西省微生物研究所，陕西西安７０４）１０３
摘要：以黑曲霉Ｔ一１Ｃ０菌株作为试验材料对其液态发酵条件及初步纯化后的柚苷酶的酶学性质进行研究。采用单因
Ａｂｔｃ：Ｉｉａｔｌ，ｔｅｇｌｓｒＴＯ１ｗｉｈｉｃｅｎｄａｘｅｍｅｔｍａｅｉｌ，ｌｕｄｅｐｒｎａｐｉｓａｔｎｔｓｒｃｅｏＡｓｒｉｕ．ｎｒｈｉｐｌＣ－ｈｃｓｓｒｅｅｓｅｐｒｎＭｔｒｓｉｉｘｅｉｉａｑｍｅｔｌｏｔ－
ＡｓｒｉｌｓｒＴＣ－ｐｅｇｌｕ．ｎＯ１
ＤＥＮＧｕｎ，ＭＡＯＹｏｇＺＹａｎ，ＨＡＮＧｉｌ，ＷＡＮＧＹａＭｅ—ｉｎ，Ｌｅ，ＬｉｏＩＦｉＩａＪ

一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710391927.6(22)申请日 2017.05.27(71)申请人华南理工大学地址 510640 广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人李晓凤　唐诗潮　赵光磊　吴晖　余以刚　唐语谦　肖性龙　刘冬梅　(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人何淑珍(51)Int.Cl.C12P 17/06(2006.01)C12R 1/685(2006.01)(54)发明名称一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法(57)摘要本发明公开了一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法。

该方法是在缓冲溶液中加入有机溶剂或者离子液体，混匀后加入柚皮苷，以黑曲霉细胞为催化剂催化柚皮苷水解反应，在20~50℃下震荡反应0~48小时，反应结束后，反应液过滤，减压蒸馏得到粗产物，产物分离提纯得到高价值、高纯度的柚皮素。

本发明柚皮素的制备方法避免了化学法污染大、对设备要求高等缺点，具有选择性好，产物纯度高，且反应条件温和、操作简便、成本低等优点，有利于工业化生产，在食品及医药生产中具有广泛用途。

权利要求书1页说明书5页CN 107119085 A 2017.09.01C N 107119085A1.一种基于黑曲霉细胞催化柚皮苷水解制备柚皮素的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）在缓冲溶液中加入有机溶剂或者离子液体，混匀后加入柚皮苷，再加入黑曲霉细胞作为催化剂催化柚皮苷水解反应；（2）反应结束后，将反应液过滤，再将滤液减压蒸馏得到粗产物，粗产物分离提纯得到柚皮素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲溶液为醋酸缓冲溶液或者柠檬酸缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述缓冲溶液的pH值为3.0~7.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜或吡啶。

产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究的开题报告

产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究的开题报告一、研究背景与意义柚叶素是一种来自柚子中的苄基化的二苯基丙烷类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、减肥、降血糖等多种药理活性。

其主要形式为柚叶素苷（naringin），是一种黄酮丙糖苷，可在体内通过酯酶水解为柚叶素。

因此，柚叶素苷是柚子中的生物前体，具有重要的发展前景。

目前，柚叶素主要从柚子中提取分离，但其收率较低且分离过程较复杂。

利用微生物发酵生产柚叶素苷是一种新的生产方式，具有生产成本低、规模化生产能力强等优点，因此备受关注。

柚叶素苷在体内通过酯酶水解为柚叶素，因此酶解柚叶素苷的酶——柚苷酶是柚叶素苷生产的关键酶。

因此，如何高效地筛选和鉴定柚苷酶高产菌株，以及对该酶的产酶特性进行研究，对柚叶素苷的生产具有重要的意义。

二、研究目的本研究旨在通过筛选、鉴定和产酶特性研究，寻找高柚苷酶产生的菌株，并对该酶的产酶特性进行探究，为柚叶素苷生产提供基础研究支持。

三、研究内容与方法1. 筛选高产柚苷酶菌株。

从自然界和土壤样品中，通过培养基筛选出菌株，利用酶促法快速鉴定柚苷酶高产菌株。

2. 鉴定柚苷酶高产菌株。

对筛选出的柚苷酶高产菌株进行16S rDNA序列分析，确定其属于的种或亚种。

3. 产酶特性研究。

利用该菌株发酵生产柚苷酶，并对该酶的反应条件、酶促性质、稳定性等多个产酶特性进行研究。

四、研究预期成果本研究预期可筛选出柚苷酶高产菌株，并对该菌株的产酶特性进行研究，从而为柚叶素苷的生产提供基础研究支持。

黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究

黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究梁新红,孙俊良,唐玉,郭祖峰（河南科技学院,河南新乡453003）摘要：纯化了黑曲霉Aspergillus niger FJL 0801糖化酶,并对其酶学性质进行研究.粗酶液经纯化后,较粗酶液纯化了38.42倍,酶活回收率达到17.45%.酶最适作用温度为60℃；最适反应pH 值为4.5；在60℃下,保温2h 后,相对酶活42%±2.8%.在pH4.5,60℃下,作用时间在60min 以内,其酶活保存89%±2.56%；其酶学性质符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,该酶比较适合应用于淀粉糖化工业.关键词：糖化酶；黑曲霉；分离纯化；酶学性质中图分类号：TS201.3文献标志码：A 文章编号：1008-7516（2011）04-0024-04Purification and properties of a glucoamylase from Aspergillus nigerLiang Xinhong,Sun Junliang,Tang Yu,Guo Zufeng（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China ）Abstract:A glucoamylase produced by Aspergillus niger FJL 0801was purified and the properties wassubsequently measured.The crude amylase was purified 38.42times with 17.45%recovery of enzyme activity.The enzyme proerties showed that the optimum pH and temperature was 4.5and 60℃,respectively.After a further reaction at pH 4.5for 2h,the relative enzyme activity is 42%±2.8%；and within 60minutes,the relative enzyme activity is 89%±2.56%.The glucoamylase is suitable for applying in starch sugar industry.Key words:glucoamylase,Aspergillus niger ,purification,properties糖化酶又称葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC 3.2.1.3）,是一种外切型糖苷酶,从淀粉的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键,水解下一个个葡萄糖单元,工业上用于将淀粉转化为葡萄糖,因而广泛地用于制药、制酒及氨基酸、有机酸行业,是最重要的工业酶制剂之一[1-2].黑曲霉（Aspergillus niger ）是生产葡萄糖淀粉酶重要菌株之一[3-4].发酵液中糖化酶的分离纯化及酶学性质研究对糖化酶在工业中应用至关重要[5].本研究拟对已筛选到的A.niger FJL 0801进行分离纯化,并研究其酶学性质,以丰富糖化酶研究内容,为可能的工业应用开发新的糖化酶资源.1试验材料与方法1.1试验材料菌种：黑曲霉（Aspergillus niger FJL 0801）,河南科技学院食品学院微生物实验室冷藏保存.DEAE-Fast Flow 阴离子交换柱（16mm ×100mm ）,Superdex-75层析柱（26mm ×600mm ）,美国惠普公司.1.2试验方法1.2.1发酵产酶条件发酵摇瓶培养基：淀粉10g ；NaNO 32g ；K 2HPO 41g ；KCl 0.5g ；M gSO 4·7H 2O 0.5g ；FeSO 4·7H 2O 0.01g ；蒸馏水1000mL,自然pH.doi:10.3969/j.issn.1008-7516.2011.04.007第39卷第4期394Vol.No.河南科技学院学报Journal of Henan Institute of Science and Technology2011年8月2011Aug.收稿日期：2011-05-18基金项目：河南省教育厅自然科学研究资助计划项目（2010A550004）；河南科技学院博士基金资助项目（08001）作者简介：梁新红（1971-）,女,河南新乡人,副教授,博士.研究方向为食品生物技术.发酵摇瓶培养：把发酵摇瓶培养基装入250mL 三角瓶中,装液量为80mL.按5%接种量把半干体培养基接种于发酵摇瓶培养基中,于33℃下恒温摇床培养,转速为210r/min.1.2.2糖化酶的分离纯化发酵液6000r/min 离心15min 去菌体,所得上清液为粗酶液,总量为200mL.粗酶液进行80%饱和的硫酸铵盐析沉淀,8000r/min 离心30min,沉淀经去离子水透析,进行冷冻干燥.冻干后,用3mL 柠檬酸-磷酸氢二钠（pH4.5）缓冲液溶解后,上DEAE-52阴离子交换柱（16mm ×100mm ）,采用10mmol 的Tris-HCl 缓冲液（含2mmol CaCl 2,pH8.4）进行平衡,上样后使用含有0~1mol NaCl 的同样缓冲液进行梯度洗脱,洗脱速度为2mL/min,收集合并酶活峰后,上预先经10mmol 的Tris-HCl （pH6.5）缓冲液平衡好的Superdex-50层析柱（26mm ×600mm ）进行洗脱,洗脱速度2mL/min,收集合并酶活峰,经去离子水透析,冻干,用于酶学性质研究.1.2.3糖化酶活力测定方法粗酶液活力按照GB/T 1805.2-93测定[6].1.2.4蛋白含量测定按Bradford 方法测定[7],以牛血清白蛋白绘制标准曲线.1.3酶学性质1.3.1最适反应温度及热稳定性在不同温度下按照标准方法测定酶活,以酶活最高者为100%.热稳定性试验中测残余酶相对活力,以未保温的酶液的酶活为100%.1.3.2酶的最适反应pH 值及pH 值稳定性将酶液分别用pH3.0~6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH6.0~8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释,按标准方法测酶活力.1.4数据处理试验平行重复4次.采用DPSv7.55数据处理软件对试验数据的方差显著性进行分析.2结果与分析2.1酶的分离纯化黑曲霉糖化酶粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-50凝胶层析后,酶蛋白得到明显纯化.糖化酶的纯化结果如表1.表1糖化酶纯化结果回收率（%）10083.3349.2117.45纯化倍数1.0010.6423.4438.42比酶活（U/mg ）1.5216.1735.6358.40总蛋白含量（mg ）78174.206123.691367.58145.60总酶活（U ）118825.3199020.3748727.058502.86纯化步骤粗酶液盐析DEAE-52Superdex-50由表1可知,纯化后酶的比活力达到了58.40U/mg,较粗酶液纯化了38.42倍.但在纯化过程中,酶活回收率达到17.45%,酶蛋白的损失主要在DEAE-52阴离子交换柱及Sephadex G-50凝胶层析.2.2酶的最适反应温度把经分离纯化的糖化酶在不同温度下测定酶的活力,以探索糖化酶最适作用温度,结果如图1.由图1可知,A.niger FJL 0801糖化酶在30~60℃的温度范围内随着温度升高,相对酶活力（相对酶活规定方法：在一定温度下所测最高酶活,其相对酶活为100%）逐渐升高,在温度为60℃时,相对酶活达最高100%.反应温度高于60℃后,相对酶活急剧下降,温度为70℃时,相对酶活只有16.57%±0.94%,当温度达到90℃时,酶活为零.因此,糖化酶最适作图1温度对A.niger FJL 0801糖化酶活性的影响梁新红等：黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究第4期用温度为60℃.2.3酶的温度稳定性把经分离纯化的糖化酶分别在30~60℃下保温2h,然后测定其残留酶活,即为糖化酶在此温度下稳定性,结果如图2.图2 A.niger FJL 0801糖化酶的温度稳定性图3pH 值对A.niger FJL 0801糖化酶活性的影响由图2可知,糖化酶经2h 保温后,在30~60℃温度范围内其酶活均有损失,温度越高,酶活损失越多.在30℃下,保温2h 后,相对酶活（在不同温度下未保温前测定酶活力的相对酶活力为100%.然后在同样温度下保温2h,再次进行酶活力的测定,测定残留酶活与未保温酶活之比为保温后的相对酶活）为92%±3.2%；在最适作用温度60℃下,保温2h 后,相对酶活只有42%±2.8%.因此,在糖化酶应用时,应同时考虑酶的最适作用温度及应用温度的稳定性,以达到最优糖化效果.2.4酶最适作用pH 值考察在pH 值范围为3.5~7.5的经分离纯化的A.niger FJL 0801糖化酶的最适反应pH 值.结果如图3.由图3可知,该酶的的最适反应pH 值为4.5,在pH4.5~5.5有较高的活力,其相对酶活（规定0h 测定酶活值的相对酶活为100%,其它时间相对酶活为测定酶活值与0h 酶活值之比）为100%±4.13%~76.23%±3.25%.在pH 为3.5和6.5时,酶活极低,相对酶活分别只有5.1%±0.26%和6.59%±0.36%,在pH 为7.0时,检测不到酶活,酶活为0.因此,糖化酶最适作用pH 值为4.5,酶应用中,溶液pH 值应高于4.0及低于6.0.2.5酶的pH 值稳定性在pH 值为4.5时60℃保存一定时间,考察最适作用pH 值稳定性.保存时间设定为0~2h,结果如图4.由图4可知,糖化酶在最适作用pH 值下,60℃作用糊精溶液0~120min,其相对酶活从100%±3.19%降至42%±2.8%,表明在最适作用温度及pH 值下,其酶活力逐渐下降.作用时间在60min 以内,其酶活保存89%±2.56%；继续增加作用时间,其酶活保存率较低,从89%±2.56%降至42%±2.8%.因此,在糖化酶应用中,在酶的最适温度和pH 值下,应掌握好酶的作用时间.3结论黑曲霉糖化酶粗酶液经硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换柱和Sephadex G-50凝胶层析后,酶的比活力达到了58.40U/mg,较粗酶液纯化了38.42倍,酶活回收率达到17.45%.图4 A.niger FJL 0801糖化酶的pH 值稳定性2011年河南科技学院学报（自然科学版）梁新红等：黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究第4期经分离纯化的糖化酶其最适作用温度为60℃；糖化酶在30℃下,保温2h后,相对酶活为92±3.2%；在最适作用温度60℃下,保温2h后,相对酶活只有42%±2.8%.酶的的最适反应pH值为4.5,在pH4.5下,60℃作用糊精溶液作用时间在60min以内,其酶活保存89%±2.56%；继续增加作用时间,其酶活保存率较低,从89%±2.56%降至42%±2.8%.通过糖化酶的最适作用温度、pH及其稳定性研究,其酶学性质基本符合淀粉糖化工业化过程中对酶的要求,该酶比较适合应用于淀粉糖化工业.参考文献：[1]Giordano R L,Trovati J,Schmidell W.Continuous production of ethanol from starch using glucoamylase and yeast co-immobilizedin pectin gel[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2008,147（1-3）：47-61.[2]李旺军,方华,谢广发,等.RSM法优化Aspergillus oryzae AO-01产糖化酶条件的研究[J].食品科学,2007,28（11）：322-327.[3]孙俊良,李新华,梁新红.不同碳源对黑曲霉产糖化酶活力的影响[J].食品科学,2008,29（8）：433-436.[4]Wang Q H,Wang X Q,Wang X M.Glucoamylase production from food waste by Aspergillus niger under submerged fermentation[J].Process Biochemistry,2008,43（3）：280-286.[5]Kumar P,Satyanarayana T.Optimization of culture variables for improving glucoamylase production by alginate-entrappedThermomucor indicae-seudaticae using statistical methods[J].Bioresource Technology,2007,98（6）：1252-1259.[6]田栖静,吴炳炎,侯炳炎,等.工业酶制剂通用试验方法[M].北京：中国轻工业出版社,1994：122-127.[7]韦平和.生物化学实验与指导[M].北京：中国医药科技出版社,2003：25-26.（责任编辑：邓天福）（上接23页）3结论根据单因素试验和正交试验所得的数据,确定柠檬蜡伞多糖的最佳提取工艺为：液料比40∶1,提取温度85℃,提取时间90min,提取2次,在此条件下,多糖含量达4.412g/100g；各种因素对提取效果影响的主次顺序依次为：提取温度＞液料比＞提取时间；提取温度、提取时间对多糖得率的影响显著（P<0.05）；液料比对多糖得率的影响不显著（P>0.05）.本实验结果可为柠檬蜡伞多糖的分离纯化及活性研究提供科学的理论依据.参考文献：[1]万宇,包金刚,图力古尔.阿尔山野生商品菌类资源[J].中国食用菌,2009,28（2）：11-13.[2]戴玉成,图力古尔.中国东北野生食药用真菌图志[M].北京：科学出版社,2007：89.[3]董爱文,符星辉,黄美娥,等.野生松乳菇和野生红汁乳菇蛋白多糖的研究[J].园艺学报,2006,33（2）：408-410.[4]杨立红,黄清荣,冯培勇,等.榛蘑多糖的分离鉴定及其清除氧自由基作用研究[J].食品科学,2007,28（1）：309-313.[5]李志洲.美味牛肝菌多糖的抗氧化性[J].食品与发酵工业,2007,33（4）：49-51.[6]田金强,朱克瑞,李新明,等.阿魏菇多糖的抗氧化功能及其对果蝇寿命的影响[J].食品科学,2006,27（4）：223-226.[7]程光宇,刘俊,王峰,等.鸡腿菇子实体多糖对小鼠血液和肝脏的抗氧化作用[J].食品科学,2010,31（13）：267-272.[8]Sun Y X,Li X,Yang J C,et al.Water-soluble polysaccharide from the fruiting bodies of Chroogomphis rutilus（Schaeff.：Fr.）O.K.M iller：Isolation,structural features and its scavenging effect on hydroxyl radical[J].Carbohydrate Polymers,2010,80（3）：720-724.[9]董群,邓丽伊,方积年.改良的苯酚-硫酸法测定多醣和寡糖含量的研究[J].中国药学杂志,1996,31（9）：550-553.[10]袁志发,周静芋.试验设计与分析[M].北京：高等教育出版社,2000：467.（责任编辑：邓天福）。

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

2021年第40卷第2期总第348期• 83 •中国酿造研究报告黑曲霉伕葡萄糖昔酶的分离纯化及酶学性质研究郭金玲，陈程鹏周一郎陈红吉'，吕育财，任立伟，龚大春(1.三峡大学湖，省生物酵素工程技术研究中心，湖,宜昌443002; 2 .三峡大学生物与制药学院，湖,宜昌443002)摘要:利用硫酸皱盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF(Q-Sepharose FF )离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF(Phenyl-Sepharose 6 FF )疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP(Butyl-Sepharose HP )疏水层析对黑曲霉来源0-葡萄糖*酶进行分离纯化，采用十二烷钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )测定其，并对其酶研究。

结果表明，得到约116 kDa 的0-葡萄糖昔酶,纯化倍数达到50.39倍，回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg ,该0-葡萄糖*酶的最适反应温度为60 !，最适反应pH 5.0,在温度30〜50 !，pH 2.0-8.0之间具有较好的稳定性。

关键词：黑曲“;0-葡萄糖*酶； '酶中图分类号：Q814.1文章编号：0254-5071 (2021)02-0083-05doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2021.02.016引文格式:郭金玲，陈程鹏,周一郎，等.黑曲“0-葡萄糖*酶的分离纯化及酶学性质研究［J ］.中国酿造,2021，40(2) ： 83-87.Isolation, purification and enzymatic properties of P-glucosidase from Aspergillus nigerGUO Jinling 1-2, CHEN Chengpeng 2, ZHOU Yilang 2, CHEN Hongji 2, LV Yucai 1-2, REN Liwei 1-2, GONG Dachun 1-2(l.Hubej Engineering Research Center fOr Biological Jiaosu, China Three Gorges University, Yichang 443002, China;2.College of B iological an= Pharmaceutical Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002, China)Abstract ： 0-glucosidase was isolated from Aspergillus niger and purified by ammonium sulfate precipitation, quaternary aminoethyl-sepharose fast flow(Q-Sepharose FF) ion exchange chromatography, phenyl-s epharose 6 fast flow (Phenyl-Sepharose 6 FF) and butyl-sepharose high performance (Butyl SepharoseHP) hydrophobic chromatography. The molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) andthe properties of the enzyme were studied. The results showed that the 0-glucosidase with molecular mass 116 kDa was obtained after purification. Thepurification fold, recovery and specific enzyme activity were 50.39, 4.65% and 103.80 U/mg, respectively. The optimum reaction temperature and pH ofthe 0-glucosidase were 60 ! and 5.0, respectively, and the enzyme had good stability at 30-50 ! and pH 2.0-8.0.Key words ： Aspergillus niger ; 0-glucosidase; isolation and purification; enzymatic property0-葡萄糖*酶(EC 3.2.1.21)又称0-D -葡萄糖*水解酶，是纤维素酶系的重要组成成分，可以水解0-D -葡萄糖昔键释放出0-D -葡萄糖,1-，被广泛应用于生物燃料,2-3-、食品问、医药保健品冋等诸多领域，具有广阔的市场应用前景。

黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

华中科技大学生命科学技术学院，武汉 J"$$%J
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摘
要
黑曲霉 W$JJ 脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、 GN8N Q29?,/’<2 W,<: W(’@ 阴离子交换层析和 Q29?,62X UL%Y 凝胶
［!-］活性平板定性检测法参照 1<JK 的方法。除特殊说明之外，脂肪酶活性测定均采用滴定法。
储油厂油污土壤中分离筛选得到。结合菌落（包括菌丝体）形态、 342+ 序列同源聚类分析和 567 序列限制性内切酶（ !"# ! ）酶切电泳图等特征，参照齐
［!#］［!&］祖同和 +889:;< 等的方法鉴定并命名为黑曲霉
!" 卷 # 期 !$$% 年 # 月
生物工程学报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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脂肪酶（ :/4,30(;(032/’( ,30(?06/’(,<2，NI "Z#Z#Z"，甘油三酰酯水解酶）是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸（或者是此反应的逆反

黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究常军;周斌;胡娜【摘要】[ Objective ] The study aimed to isolate the exocellular β-glucosidase from Aspergillus niger that could hydrolyze the swertiamarin and research its molecular weight, optimal catalytic temperature, optimal pH, stability and catalytic characteristics. [ Method ] The A. niger liquid was fermented for 3 d and then its culture liquid was collected. After the culture liquid was made through the salting out and column separation, a β-glucosidase was gained. [ Result] The β-glucosidase had the molecular weight of 86 kD, the optimal pH of 5.0 -6.0, the optimal reaction temperature of 50 -60 ℃ and showed stable at below 60 ℃. TheCa2+ ,Zn2+ , Fe3+ and Cu2+ could restrain the activity of the βglucosidase and the Mg2+ and Mn2+ could activate its activity. Cellobiose was the optimal catalytic substrate of β-glucosidase. [ Conclusion] This enzyme, similar to the most A. niger from the fungi, showed the weak affinity to the swertiamarin and the strong affinity to p-NPG.%[目的]分离能水解獐牙菜苦苷的胞外β-葡萄糖苷酶,并研究其分子量、最适催化温度、最适pH、稳定性及催化特征.[方法]黑曲霉液体发酵3 d,收集培养液,培养液经盐析、柱分离得到1个β-葡萄糖苷酶.[结果]该β-葡萄糖苷酶的分子量的86 kD,最适pH为5.0～6.0,最适反应温度为50～60℃,在60℃以下时酶稳定;Ca2+、Zn2+、Fe3+和Cu2+能抑制β-葡萄糖苷酶的活性,而Mg2+和Mn2+能够激活β-葡萄糖苷酶的活性;纤维二糖是该β-葡萄糖苷酶的最适催化底物.[结论]该酶和大多数真菌来源黑曲霉相似,对獐牙菜苦苷的亲和性弱,对p-NPG的亲和力强.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)019【总页数】4页(P11374-11376,11379)【关键词】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;分离;纯化【作者】常军;周斌;胡娜【作者单位】江西科技师范学院生命科学学院,江西,南昌,330038;江西科技师范学院药学院,江西,南昌,330038;江西科技师范学院生命科学学院,江西,南昌,330038【正文语种】中文【中图分类】S188β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.2.21)又称β-D-葡萄糖苷酶，属于纤维素酶类。

黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质刘中美;谢梦圆;周哲敏【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2015(034)011【摘要】“绿色资源”纤维素广泛应用于能源、医药、食品等领域,β-葡萄糖苷酶(BGL)作为纤维素降解酶系的限速酶是当前研究热点之一.作者对黑曲霉利用豆渣发酵所产的胞外β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,并对该酶进行了酶学性质表征.实验结果表明,BGL最适反应温度为55℃,最适反应pH为2.0～2.5,pH稳定范围为2.0～7.5.在最适反应条件下,Km值为8.4×10-4 mol/L,kcat为16 s-1,催化效率kcat/Km为1.92×104 L/(mmol·s).相比较其他报道的BGL酶,该酶具有更好的耐酸性能,可为BGL的理论研究与酶制剂的生产应用提供一定基础.【总页数】5页(P1198-1202)【作者】刘中美;谢梦圆;周哲敏【作者单位】江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q55【相关文献】1.黑曲霉变种RM48 α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究 [J], 许尧兴;李艳丽;柳永;许少春;姚晓红2.黑曲霉葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 常军;周斌;胡娜3.黑曲霉胞外β-葡萄糖苷酶的纯化及酶学性质的研究 [J], 徐星;肖华;黄琳琳;别松涛4.黑曲霉CICIM F0410中α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究 [J], 周敏;王正祥5.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 郭金玲;陈程鹏;周一郎;陈红吉;吕育财;任立伟;龚大春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种同时高产柚苷酶和橙皮苷酶的黑曲霉菌WZ001及其应用[发明专利]

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101089175A [43]公开日2007年12月19日[21]申请号200610051963.X [22]申请日2006.06.14[21]申请号200610051963.X[71]申请人浙江工业大学地址310014浙江省杭州市下城区朝晖六区[72]发明人汪钊 [74]专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司代理人黄美娟袁木棋[51]Int.CI.C12N 1/20 (2006.01)C12N 9/24 (2006.01)C12P 1/02 (2006.01)C12R 1/685 (2006.01)权利要求书 2 页说明书 6 页[54]发明名称一种同时高产柚苷酶和橙皮苷酶的黑曲霉菌WZ001及其应用[57]摘要本发明提供了一种可同时高产柚苷酶和橙皮苷酶、并能实现工业化生产的黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)及其应用。

所述黑曲霉菌WZ001保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.206047，保藏日期2006年5月15日，提议的分类命名为黑曲霉菌WZ001。

本发明所述的黑曲霉菌WZ001产酶量高，采用液态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到14000U/g发酵原料以上；采用固态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到6000U/g发酵原料以上。

200610051963.X权利要求书第1/2页1.一种黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号C C T C C N o.206047，保藏日期2006年5月15日。

2.如权利要求1所述的黑曲霉菌WZ001，其特征在于所述黑曲霉菌W Z001菌落特征如下：在斜面生长速度较快，在30℃条件下，一般需3-5天，菌落初期呈白色绒毛状，呈扩散状，表面较干燥，菌落后期生出棕褐色的孢子，分生孢子头幼时呈球形，具有分生孢子梗，壁光滑，顶囊球型，小梗双层，自顶囊全面着生，分生孢子球型或近球型，壁粗糙，摇瓶发酵后呈较浓的丝状，培养时间过长，菌丝体会自溶。

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黑曲霉液态发酵产柚苷酶的分离纯化及其性质研究王维娜1，李佥1，田晶1，费旭2，徐龙权2，廉萌1(1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034)(2.大连工业大学现代教育技术部，辽宁大连 116034)摘要：本文针对黑曲霉液态发酵所产柚苷酶的分离纯化工艺及其酶学性质进行研究。

将黑曲霉液态发酵所产酶液，依次通过30%~70%硫酸铵盐析、膜透析和DEAE-Sepharose FF 阴离子交换层析后得到高纯度柚苷酶。

经SDS-PAGE 凝胶电泳仅得到一条清晰条带，分子量约为65.10 ku 。

纯化获得的柚苷酶比酶活可达6932.54 U/mg ，纯化倍数和酶活回收率分别为13.82倍和13.30%，并且能有效水解柚皮苷。

进一步研究发现，该酶的最适反应pH 为4.5，最适作用温度为50 ℃，在20 ~50 ℃℃及pH 3.0~6.0范围内有良好的稳定性。

在一定浓度范围内，K +、Ca 2+和Na +对柚苷酶活性有促进作用，而Fe 3+、SDS 和EDTA-Na 2对其活性有明显的抑制作用。

本研究为深入理解柚苷酶分离纯化过程，明确其酶学性质，进一步探索柚苷酶应用于天然活性产物生物转化过程的相关机制提供了基础数据，具有非常重要的科学意义和潜在的应用价值。

关键词：黑曲霉；液态发酵；柚苷酶；纯化；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)07-72-78 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.7.012Isolation, Purification, and Properties of Naringinase Produced fromAspergillus niger FFCC 848 by Liquid FermentationW ANG Wei-na 1, LI Qian 1, TIAN Jing 1, FEI Xu 2, XU Long-quan 2, LIAN Meng 1(1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China) (2.Modern Education Technical Department, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)Abstract: The isolation, purification, and enzymatic properties of naringinase produced by liquid fermentation with Aspergillus niger FFCC 848 were investigated. The fermentation broth produced from liquid fermentation by A. niger FFCC 848 was purified by ammonium sulfate fractional precipitation, dialysis, and DEAE-Sepharose FF anion exchange chromatography to yield highly purified naringinase. Only one clear band was observed upon sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, with a molecular weight of 65.10 ku. The final, purified naringinase showed 13.82-fold purification, with an enzyme activity recovery of 13.30% and specific activity of 6932.54 U/mg, and the enzyme could effectively hydrolyze naringin. Furthermore, the activity of naringinase was stable at 20–50°C and pH 3.0–6.0; optimum activity was observed at 50°C and pH 4.5. In a specific concentration range, the enzyme activity was enhanced by K +, Ca 2+, and Na +, but was strongly inhibited by Fe 3+, SDS, and EDTA-Na 2. This study provides a basis for understanding the purification of naringinase and for further studies of the related mechanism underlying the bioconversion of bioactive natural products with naringinase.Key words: Aspergillus niger ; liquid fermentation; naringinase; purification; enzymatic properties柚苷酶（EC 3.2.1.40）是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成，同时具有α-L-鼠李糖酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。

因其能水解柚苷类果汁中的苦味物质柚皮苷，使其为低苦味物质，因此在柑桔类水果加工、食品增香、制药工业等方面具有重要用途[1]。

在柚苷72收稿日期：2015-07-21基金项目：辽宁省自然科学基金（2013020167）；辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2015045）；大连工业大学青年基金（67007908）作者简介：王维娜（1990-），女，在读研究生，研究方向：生物催化与生物分析通讯作者：李佥（1982-），女，博士，讲师，研究方向：生物催化与生物分析；田晶（1966-），女，博士，教授，研究方向：生物催化与生物分析酶水解柚皮苷脱苦的过程中，α-L-鼠李糖苷酶首先将柚皮苷（4,5,7-三羟基二氢黄酮-7-鼠李葡萄苷）水解为L-鼠李糖和普鲁宁，然后β-D-葡萄糖苷酶将普鲁宁水解为葡萄糖和非可逆的柚皮素（4,5,7-三羟基二氢黄酮）以达到脱苦的作用。

由于第一步反应的关键性作用，因此有很多学者将α-L-鼠李糖苷酶的活性等同于柚苷酶的活性进行研究[2]。

柚苷酶的来源广泛，包括植物、动物和微生物。

目前柚苷酶主要由微生物发酵获得，常用菌种为曲霉属和青霉属真菌。

其中，黑曲霉的液态发酵工艺研究较为深入，具有操作简便、不易受杂菌污染并且产量较高的优点。

另一个重要的研究方向是如何获得高纯73度柚苷酶。

文献报道，胡群芳等[3]采用硫酸铵沉淀、疏水层析、HiTrap Blue HP 亲和层析和Sephacryl S-200 HR 凝胶过滤层析分离到一种分子量为160 ku 的α-L-鼠李糖苷酶；Koseki 等[4]采用硫酸铵沉淀、DEAE-5PW 离子层析、超滤和G3000-SWXL 凝胶层析得到分子量为90 ku 的α-L-鼠李糖苷酶；Chang 等[5]利用Aspergillus sojae 发酵产生柚苷酶，依次通过硫酸铵沉淀、Q-sepharose 离子层析、超滤和Superdex 200凝胶层析得到分子量为70 ku 的柚苷酶，对柚皮苷具有较高的的转化效率，同时该菌株也产生低活性的β-D-葡萄糖苷酶；Puri 等[6]对Aspergillus niger 1344发酵液进行超滤、硫酸铵沉淀、Q-sepharose 离子层析、超滤及Superdex G-200凝胶层析后得到电泳纯α-L-鼠李糖苷酶。

目前，国内外关于柚苷酶的研究虽然取得了很多进展，但由于发酵所得粗酶液的酶活力较低，而下游分离纯化工艺往往占生产总成本的40%~50%[7]，使得柚苷酶制剂产品的价格居高不下。

因此，如何通过较少的分离纯化步骤即可获得高纯度柚苷酶，是降低生产成本、提高酶活回收率和扩大柚苷酶工业化应用范围的关键问题。

本研究采用实验室自主保藏的1株黑曲霉进行液态发酵生产柚苷酶，通过简单的硫酸铵盐析、膜透析和一步离子交换层析即可获得高纯度柚苷酶，同时对影响该酶酶学性质的各因素进行了深入探讨。

本工作不仅能够减少柚苷酶的分离纯化步骤，在一定程度上降低生产成本，还为深入了解柚苷酶酶学性质和柚苷酶生物转化过程的相关机制研究提供了基础数据，对推动柚苷酶生产，拓宽其应用研究领域具有十分重要的意义。

1 材料与方法 1.1 实验材料菌株：黑曲霉FFCC 848，大连工业大学菌种保藏中心保藏。

材料：牛血清白蛋白（BSA ），购自国药集团化学试剂有限公司；柚皮苷（≥98%），购自宝鸡市方晟生物开发有限公司；普鲁宁（≥98%），上海源叶生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝胶电泳标准蛋白，购自中国科学院上海生化研究所；考马斯亮蓝R-250，天津光复化学试剂厂；DEAE-Sepharose FF ，购自Pharmacia 公司；薄层层析板，德国Merk 公司提供。

其他化学试剂皆为分析纯。

仪器设备：Lambda-35型紫外分光光度计，购自美国PE 公司；HH-8数显恒温水浴锅，购自江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；真空冷冻干燥机，北京比朗实验设备有限公司；TGL-16G 高速离心机，购自上海安亭科学仪器厂；电泳用MV-IIA 型双垂直板电泳槽、JM-250型电泳仪，购自大连竞迈生物科技有限公司。

1.2 培养基斜面培养基（g/L ）：NaNO 3 3.0，FeSO 4·7H 2O 0.01，K 2HPO 4·12H 2O 1.0，MgSO 4·7H 2O 0.5，KCl 0.5，蔗糖30.0，琼脂20.0，柚皮苷2.0，pH 6.0。

液体发酵培养基（g/L ）：KH 2PO 4·2H 2O 1.5，MgSO 4·7H 2O 0.5，(NH 4)2SO 4 4.0，ZnSO 4·7H 2O 0.09，CaCl 2 0.1，豆粉2.0，蛋白胨2.0，酵母浸粉1.0，柚皮苷6.0，pH 6.0。

1.3 实验方法 1.3.1 菌种的培养将黑曲霉FFCC 848孢子转接到斜面培养基上，于30 ℃恒温培养4~5 d ，待斜面上长满黑褐色孢子后，用0.9%（m/V ）无菌生理盐水将孢子洗下，加入到装有玻璃珠的锥形瓶中，30 ℃振荡培养l h 后配成OD 600为0.2的孢子悬浊液，按10%（V/V ）接种量接种于液体发酵培养基中，30 ℃，180 r/min 培养4~5 d 。