毒理学实验方案

5-甲基水杨酸和水杨酸毒理性质研究实验方案
一、鱼类急性毒性实验—半数致死浓度（LC50）的测定
按照《GB/T 21281-2007 危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》进行
1.1实验鱼的选择和驯养
1.1.1实验鱼的选择
斑马鱼：斑马鱼是一种常见的热带淡水鱼，体型小，在较小空间内就可饲养大量斑马鱼(2L的鱼缸中就可饲养10条左右)。

斑马鱼世代周期短，繁殖率高，饲养管理廉价方便，饲养成本低，对水质的要求不高。

因此斑马鱼长期以来被广泛用于胚胎学、发育生物学、毒理学和分子生物学等研究,被喻为理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型,是四大模式生物之一,也是国际标准化组织(ISO)推荐使用的标准化鱼类毒性实验动物和我国国家环保部、化学农药环境安全评价准则指定的鱼类毒性实验鱼种之一。

拟从较近的位于沪闵路的闵行悠闲水族购得斑马鱼150条。

同批、同种、同龄,大小均匀,体质健壮,个体全长以1.0～6.0 cm为宜,最大个体不可大于最小个体的50%。

1.1.2实验鱼的驯养
实验鱼用于试验之前,在与实验用水质、温度和光照相同的水中驯养7 d,以使鱼类适应实验室的生活环境,如水温、水质和光线等,且便于对实验鱼进行健康选择。

驯养期间,应每天换水、喂食1～2次,实验开始前24h停止喂食。

密切检查鱼的健康状况,发现受伤、体色异常、消瘦、离群游泳、行动呆滞和拒食等现象,应及时除去。

驯养开始48 h 后记录死亡率,死亡率小于5%方可用于实验。

1.2实验条件
实验用水（稀释水）：自来水，人工曝气或放置3 d以上脱氯。

水的总硬度为10～250 mg/L(以CaCO3计),pH值为6.0～8.5。

实验容器：其他实验室的鱼缸三个，以及2L的烧杯四个，洗净后用曝气后的自来水涮洗。

1.3实验步骤
1.3.1方案一：进行预实验后再进行正式实验
1.3.1.1预实验：预备实验用于确定正式实验浓度的大致范围,了解实验溶液浓度的稳定性,以及实验过程中pH、溶解氧等变动情况。

如果能从同系物毒性或文献资料估计被测试化学物质或工业废水的大致毒性,可直接进行正式实验。

实验内容：选择1 000,100,10,1,0.1,0 mg/L,5个浓度梯度每个浓度组放入5条鱼,用静水式进行,不设平行组。

实验持续24～96 h,每日至少记录2次各容器内的死鱼数,并及时清除死鱼。

求出24 h100%死亡浓度(24 h LC100)和96 h无死亡浓度(96 hLC0)。

1.3.1.2正式实验：
根据预实验结果，按等对数间距设置5个实验浓度组，包括使鱼24h全部死亡或接近全部死亡的最低浓度（24hLC100）和96h使鱼全部存活或接近全部存活的最高浓度（96hLC0）。

每组设一个平行，设置空白对照和助溶剂对照组，助溶剂浓度与各实验组中最高助溶剂浓度相同。

每个实验容器投放10尾鱼，染毒96h。

给鱼分组限制在30分钟内。

在1.5h、3h、6h、12h、24h、48h、72h和96h，分别检查受试鱼的状况。

观察并纪录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出，以免影响水质。

纪录实验鱼的异常行为，如鱼体侧翻、失去平衡、游泳能力和呼吸功能减弱以及色素沉积等。

实验采用静态换液法，每天更换1/2试液，实验前24h停止给实验鱼喂食，整个实验期间亦不喂食。

以丙酮为助溶剂进行四种化合物对斑马鱼的单一急性毒性实验，以死亡率作为观察指标，参照改进寇氏法，计算相应时间的LC50。

所有数据由2组平行实验得到。

半致死浓度的计算公式为改进寇氏法:
改进寇氏法计算LC50步骤：其中浓度单位为mg/L
（1）公差d: i为浓度组数
（2）求LC50：P i为第i组浓度的存活率，以小数表示（3）标准差：n为每组浓度的鱼数
（4）求95%可信区间
利用计算得到的鱼试验96h的LC50值，根据《全球化学品分类和标签协调手册》（GHS）对受试物质的急性水环境毒性进行分级，分级判定见表1。

安全浓度C0=0.1*LC50
二、测定斑马鱼超氧化物岐化酶（SOD）
抗氧化防御系统是鱼体内重要的活性氧清除系统.当生物体内活性氧自由基生成量增加时,其活性防御成分抗氧化酶和部分抗氧化剂的合成随即增加,因此,抗氧化防御系统成分的改变可以作为机体遭受氧化胁迫的早期预警生物标志物.抗氧化防御系统主要包括抗氧化酶以及抗氧化小分子.前者如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),后者包括谷胱甘肽(GSH)、维生素E和胡萝卜素等。

超氧化物岐化酶(SOD)活性单位定义为:每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个单位。

SOD活性的测定采用黄嘌呤氧化酶法(试剂盒购自南京建成生物工程研究所，50管/48样，价格300RMB)
方案一：在测定LC50的同时，研究不同浓度的受试物对斑马鱼体内超氧化物歧化酶的影响。

试验进行96h后每组浓度取出3尾斑马鱼，活体解剖,取出肝脏,迅速置于冰浴中,按1∶30(质量浓度)的比例加入预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7·5),匀浆后将匀浆液于4℃,10 000 r/min 下离心15 min,取上清液置于-75℃冰箱中保存,用于SOD和蛋白质含量测定方案二：在急性毒性试验结束后，设5个浓度梯度:0、1/6 LC50、1/4 LC50、1/3 LC50、1/2 LC50.每个浓度组10尾鱼, ,每天更换相同浓度的溶液1/2,投放定量观赏鱼饲料。

分别于暴露的0.5、1、2、4、7、14 d取样,将3尾斑马鱼活体解剖,取出肝脏,迅速置于冰浴中,按1∶30(质量浓度)的比例加入预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7·5),匀浆后将匀浆液于4℃,10 000 r/min下离心15 min,取上清液置于-75℃冰箱中保存,用于SOD活性分析和蛋白质
含量测定。

水杨酸毒理学数据：LD50 大鼠经口891mg/kg，皮肤＞2000 mg/kg，腹腔注射157mg/kg，小鼠经口480 mg/kg，腹腔注射300 mg/kg，静脉注射184 mg/kg，LC50 大鼠吸入＞900 mg/m3/1 hr。