核酸的研究方法
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ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
（二）测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系
ρ=0.100xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低， 低于理论值。
范树国
DNP 可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿 异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。
（二）RNA的分离
RNase 的灭活：
玻璃器皿：140-200℃，8h 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
（三）核酸含量的测定方法
核酸纯度的鉴定可通过测定样品在 260 nm 和 280nm 的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电 泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ①磷的测定 RNA中含磷量为 9.0％， DNA中含磷量为 9.2％，因此每测得 1g磷就相当于含有 11g核酸。含 磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变 成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色 的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量 成正比，可在 660nm 比色测定。从磷的标准曲线可 知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。
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范树国
二、核酸的超速离心
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和 沉降速率不同，用 CsCl 密度梯度离心可以将不同构 象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部） 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
（一）双脱氧终止法
英国 1955 1975 Sanger 确定牛胰岛素结构， 1958 设计出DNA测序法， 1980
获诺贝尔化学奖 获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
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范树国
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
双脱氧核苷酸测序法（MOV）
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（一）DNA分离
真核 DNA 以核蛋白（ DNP ）形式存在， DNP 溶于水或 高 盐 溶 液 （ 1mol/L NaCl ） ， 但 不 溶 于 低 盐 溶 液 （0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐 沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
楚雄师范学院化学与生命科学系
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
★用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核 蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法
★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法
染色：0.5μg/ml EB（溴化乙锭） RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛
楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国
琼脂糖电泳可以用于 DNA 分子量的测定 琼脂糖电泳还可以用于 DNA的制备与纯化
（二）PAGE电泳
用于小片段DNA的分析， 精度非常高
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范树国
四、核酸的核苷酸序列测定
范树国
DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP
（二）化学裂解法 Maxam-Gilbert，1977
原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个 核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和 放射自显影得到测序图谱。
32P-GCTACGTA：
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②核糖和脱氧核糖的测定
RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利 用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质， 在670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对 应的RNA的含量。 DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条 件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色 化合物，在595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线 中查得对应的DNA的含量。
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（三）溶液中核酸构象的研究
浮力密度： RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质，
变性程度越大，浮力密度越大
超螺旋DNA或
三、核酸的凝胶电泳
（一）琼脂糖电泳
用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。 影响迁移率的因素：
① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 ② 凝胶浓度 ③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢 ④ 电流，不大于5V/cm
第十五章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成
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范树国
一、核酸的分离、纯化和定量测定
尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。
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wenku.baidu.com范树国
③紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样 品在 260 nm 和 280 nm 的光吸收值（ A 值），从 A260 ／ A280 的比值可判断样品的纯度。纯 DNA 的 A260/A280 应为 1.8 ，纯 RNA 应为 2.0 。样品中如含有杂蛋白及苯酚， A260/A280 比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸 收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A 值即可算出含量。通常以 1A值相当于 50μg/mL双螺旋 DNA 或 40μg/mL单链 DNA （或 RNA ）或 20μg/mL寡核苷 酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样 品。
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（二）测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系
ρ=0.100xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低， 低于理论值。
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DNP 可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿 异戊醇去除蛋白质。 水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。
（二）RNA的分离
RNase 的灭活：
玻璃器皿：140-200℃，8h 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜 提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂
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（三）核酸含量的测定方法
核酸纯度的鉴定可通过测定样品在 260 nm 和 280nm 的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电 泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ①磷的测定 RNA中含磷量为 9.0％， DNA中含磷量为 9.2％，因此每测得 1g磷就相当于含有 11g核酸。含 磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变 成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色 的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量 成正比，可在 660nm 比色测定。从磷的标准曲线可 知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。
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二、核酸的超速离心
不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和 沉降速率不同，用 CsCl 密度梯度离心可以将不同构 象DNA、RNA与蛋白质区分开来 这一方法常用于质粒DNA的纯化。
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（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部） 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
（一）双脱氧终止法
英国 1955 1975 Sanger 确定牛胰岛素结构， 1958 设计出DNA测序法， 1980
获诺贝尔化学奖 获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
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范树国
双脱氧核苷酸测序法（MOV）
楚雄师范学院化学与生命科学系
（一）DNA分离
真核 DNA 以核蛋白（ DNP ）形式存在， DNP 溶于水或 高 盐 溶 液 （ 1mol/L NaCl ） ， 但 不 溶 于 低 盐 溶 液 （0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐 沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。
楚雄师范学院化学与生命科学系
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
★用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核 蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法
★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法 蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法
染色：0.5μg/ml EB（溴化乙锭） RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛
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琼脂糖电泳可以用于 DNA 分子量的测定 琼脂糖电泳还可以用于 DNA的制备与纯化
（二）PAGE电泳
用于小片段DNA的分析， 精度非常高
楚雄师范学院化学与生命科学系
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四、核酸的核苷酸序列测定
范树国
DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP
（二）化学裂解法 Maxam-Gilbert，1977
原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个 核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和 放射自显影得到测序图谱。
32P-GCTACGTA：
楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国
②核糖和脱氧核糖的测定
RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利 用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质， 在670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对 应的RNA的含量。 DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条 件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色 化合物，在595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线 中查得对应的DNA的含量。
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（三）溶液中核酸构象的研究
浮力密度： RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质，
变性程度越大，浮力密度越大
超螺旋DNA或
三、核酸的凝胶电泳
（一）琼脂糖电泳
用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。 影响迁移率的因素：
① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 ② 凝胶浓度 ③ DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢 ④ 电流，不大于5V/cm
第十五章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定 二、核酸的超速离心 三、核酸的凝胶电泳 四、核酸的核苷酸序列测定 五、DNA聚合酶链反应（PCR） 六、DNA的化学合成
楚雄师范学院化学与生命科学系
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一、核酸的分离、纯化和定量测定
尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。 条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。
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③紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样 品在 260 nm 和 280 nm 的光吸收值（ A 值），从 A260 ／ A280 的比值可判断样品的纯度。纯 DNA 的 A260/A280 应为 1.8 ，纯 RNA 应为 2.0 。样品中如含有杂蛋白及苯酚， A260/A280 比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸 收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A 值即可算出含量。通常以 1A值相当于 50μg/mL双螺旋 DNA 或 40μg/mL单链 DNA （或 RNA ）或 20μg/mL寡核苷 酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样 品。