农杆菌及其瞬时转化技术

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应用
• 外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实 验系统。具体可应用于以下几个方面:
• 第一、 外源基因表达分析 • 第二、启动子对基因表达调控的研究 • 第三、基因沉默研究中的应用 • 第四、宿主抗性( R) 基因与病原物无毒( Avr) 基因的相
互作用研究
植物瞬时表达系统
• 当外源基因导入植物细胞中以后,其表达方式有瞬时表达 和稳定表达两种。在瞬时表达状态的基因转移中,引入细 胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些 DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达,并持续 约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中,导入宿主 细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上,以永久形式存在, 并可传给后代,形成稳定的转化细胞
(1)诱导目标植物外植体; (2)构建含有目的基因的质粒; (3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程; (4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染; (5)共培养及脱菌处理; (6)愈伤组织筛选、分化与植株再生; (7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测; (7)转基因第一代的目标性状鉴定。
农杆菌及其介导的瞬时表达 技术
——生科101 杨鑫 李欣
农杆菌(Agrobacterium)
农杆菌是生活在植物 根的表面依靠由根组 织渗透出来的营养物 质生存的一类革兰氏 阴性细菌。
农杆菌的生理形态特征
农杆菌喜欢生活在土壤 中,特别是耕种过的田 地里,因为经过耕种的 土壤疏松,适宜根癌农 杆菌生长。 农杆菌的身体呈棒状, 有细胞壁,长两到三个 微米,有鞭毛生长在侧 边,依靠鞭毛运动。
农杆菌的分类
• 农杆菌主要有两种:根癌农杆菌和发根农杆菌 • 根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子
叶植物或裸子植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。这 种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积 发生。 • 发根农杆菌则诱导产生发状根,其特征是大量增生高度 分支的根系。
农杆菌介导法的基本步骤
农杆菌介导法的优缺点
• 具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、 基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段 明显及实验费用低等优点。
• 农杆菌介导法也存在一些问题。首先,在自然条件下,农 杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物,虽然可以采用 人工添加酚类物质的方法,诱导农杆菌完成侵染过程,但 是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前,只发现20 多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次,植物细胞壁对农 杆菌介导转化效果有一定影响。再次,影响农杆菌转化效 率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时,研究者要考虑 农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况;外 植体的基因型、来源和发育状态;培养基成分及某些诱导 条件如是否加入酚类物质等。
• 然后用农杆菌渗入法感染植物,用针头在植株叶片上扎两 个孔,用无针头的针管注射叶片,依靠压力将菌液注入叶 片的叶脉之间。该过程通过酚类化合物起着很大的作用。
技术流程
农杆菌表达检测
• 瞬时表达的检测一般在注射后几天内进行检测或者进一步 分析,检测部位一般为注射部位。不同的柿物在注射后表 达量随时间而变化,检测方法也依目的而定,如蛋白表达 一般在注射农杆菌2~3 d后,收获注射叶片并进行蛋白提 取纯化以及相应的Western blot等分子生物学检测。抗病 毒分析等一般在注射后4 d在注射叶片上进行攻毒实验并 对其症状进行观察及相应的分子生物学分析。本氏烟转基 因16c植株经常作为瞬时表达研究基因沉默或抑制子功能 的受试植株,注射后进行局部或者整株分析。绿色荧光蛋 白(GFP)或gus基因常作为标记基因辅助显微分析等手段, 在整个植株中对瞬时表达过程进行跟踪分析,如分析不同 寄主病毒致病性中病毒感染部位,病毒复制,胞间运动, 远程运化到根癌农杆菌中,后者 经酚类化合物(如乙酰丁香酮)诱导处理,在转录水平 激活Vir区基因,真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片 细胞接触,从而实现T-DNA转移进入植物细胞核。大 部分T- DNA 并未整合入植物基因组而是暂时存在于 核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达 T- DNA 基因, 通常在数小时后即可检测到外源基因的 表达, 并在1~2 d 内达到最高值。而少量整合进植物 染色体的T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
具体流程简介
• 首先获得目的基因序列,将目的基因插入到表达载体中, 如pBIl2l、pMOG800等,再转化到农杆菌细胞中。目前常 用于介导转化植物的农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、 AGLl等菌株。
• 其次,将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基培养至对 数生长期,离心收集菌体,加入浸润缓冲液,重悬至 OD600值约为0.1~1.5,室温静置2~3 h后用于浸润。
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