农杆菌及其瞬时转化技术

应用
• 外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实 验系统。具体可应用于以下几个方面:
• 第一、 外源基因表达分析 • 第二、启动子对基因表达调控的研究 • 第三、基因沉默研究中的应用 • 第四、宿主抗性( R) 基因与病原物无毒( Avr) 基因的相
互作用研究
植物瞬时表达系统
• 当外源基因导入植物细胞中以后，其表达方式有瞬时表达 和稳定表达两种。在瞬时表达状态的基因转移中，引入细 胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些 DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续 约80小时左右。在稳定表达状态的基因转移中，导入宿主 细胞的DNA整合到细胞染色体DNA上，以永久形式存在， 并可传给后代，形成稳定的转化细胞
(1)诱导目标植物外植体； (2)构建含有目的基因的质粒； (3)质粒导人合适的农杆菌菌株中及该菌株的活化过程； (4)植物愈伤组织的微伤口处理及农杆菌侵染； (5)共培养及脱菌处理； (6)愈伤组织筛选、分化与植株再生； (7)再生植株及其后代的外源基因及其表达产物的分子检测； (7)转基因第一代的目标性状鉴定。
农杆菌及其介导的瞬时表达 技术
——生科101 杨鑫 李欣
农杆菌（Agrobacterium)
农杆菌是生活在植物 根的表面依靠由根组 织渗透出来的营养物 质生存的一类革兰氏 阴性细菌。
农杆菌的生理形态特征
农杆菌喜欢生活在土壤 中，特别是耕种过的田 地里，因为经过耕种的 土壤疏松，适宜根癌农 杆菌生长。 农杆菌的身体呈棒状， 有细胞壁，长两到三个 微米，有鞭毛生长在侧 边，依靠鞭毛运动。
农杆菌的分类
• 农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌 • 根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子
叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。这 种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积 发生。 • 发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度 分支的根系。
农杆菌介导法的基本步骤
农杆菌介导法的优缺点
• 具有操作简单、转化效率较高、重复性好、单拷贝整合、 基因沉默现象少、转育周期短、转化片段较大且插入片段 明显及实验费用低等优点。
• 农杆菌介导法也存在一些问题。首先，在自然条件下，农 杆菌只侵染双子叶植物。对于单子叶植物，虽然可以采用 人工添加酚类物质的方法，诱导农杆菌完成侵染过程，但 是单子叶植物的组织培养有一定的难度。目前，只发现20 多种单子叶植物能被农杆菌侵染。其次，植物细胞壁对农 杆菌介导转化效果有一定影响。再次，影响农杆菌转化效 率的因素较多。在设计农杆菌介导实验时，研究者要考虑 农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况；外 植体的基因型、来源和发育状态；培养基成分及某些诱导 条件如是否加入酚类物质等。
• 然后用农杆菌渗入法感染植物，用针头在植株叶片上扎两 个孔，用无针头的针管注射叶片，依靠压力将菌液注入叶 片的叶脉之间。该过程通过酚类化合物起着很大的作用。
技术流程
农杆菌表达检测
• 瞬时表达的检测一般在注射后几天内进行检测或者进一步 分析，检测部位一般为注射部位。不同的柿物在注射后表 达量随时间而变化，检测方法也依目的而定，如蛋白表达 一般在注射农杆菌2～3 d后，收获注射叶片并进行蛋白提 取纯化以及相应的Western blot等分子生物学检测。抗病 毒分析等一般在注射后4 d在注射叶片上进行攻毒实验并 对其症状进行观察及相应的分子生物学分析。本氏烟转基 因16c植株经常作为瞬时表达研究基因沉默或抑制子功能 的受试植株，注射后进行局部或者整株分析。绿色荧光蛋 白(GFP)或gus基因常作为标记基因辅助显微分析等手段， 在整个植株中对瞬时表达过程进行跟踪分析，如分析不同 寄主病毒致病性中病毒感染部位，病毒复制，胞间运动， 远程运化到根癌农杆菌中，后者 经酚类化合物(如乙酰丁香酮)诱导处理，在转录水平 激活Vir区基因，真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片 细胞接触，从而实现T-DNA转移进入植物细胞核。大 部分T- DNA 并未整合入植物基因组而是暂时存在于 核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达 T- DNA 基因, 通常在数小时后即可检测到外源基因的 表达, 并在1～2 d 内达到最高值。而少量整合进植物 染色体的T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
具体流程简介
• 首先获得目的基因序列，将目的基因插入到表达载体中， 如pBIl2l、pMOG800等，再转化到农杆菌细胞中。目前常 用于介导转化植物的农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、 AGLl等菌株。
• 其次，将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基培养至对 数生长期，离心收集菌体，加入浸润缓冲液，重悬至 OD600值约为0．1～1．5，室温静置2～3 h后用于浸润。