土壤真菌：多样性和检测

土壤真菌：多样性和检测摘要：大部分目前命名和描述的80，000多真菌物种的生命周期似乎只在土壤环境中的某些阶段才会发生。

因此，真菌在土壤中具有很多不同的功能，包括活跃角色，例如降解死亡植物组织；或不活跃角色，作为休眠的土壤中出现的繁殖体。

目前土壤真菌多样性的影响的知识主要基于对环境中出现的真菌体的观察，或者来自于土壤分离培养所得。

这两种方法无论对于任何一种环境来说，检测其真实的真菌多样性都存在巨大的缺陷。

如果子实体没有形成，只是土壤中出现了菌丝体，通过直接观察的方法似乎不能进行鉴定。

因此，传统的通过直接显微镜观察会大大降低环境中真实的多样性。

从土壤中分离培养真菌只能检测那些可以在分离培养基上生长和产生孢子的繁殖体。

这也将会导致检测到的多样性大大降低，因为目前已知的可成功培养的真菌大概只有17%。

从土壤中恢复培养真菌也无法区分真菌在原来的生态系统中是活跃的还是处于休眠期。

分子技术的发展提供了观察和研究土壤环境中明确的相互作用和活力的一系列新的工具。

广谱PCR检测结合SSCP或者DGGE可以为生态系统多样性基本问题提供更加准确的答案。

但是，这些技术不能区分活的和休眠期的物种，因此为了更好的理解其结果，需要对这些微生物的生态学和功能进行推理和演绎。

简介真菌是微生物的一个巨大多样性组合体，包括一系列大型形式，从显微镜单细胞酵母到体积庞大的大型菌，例如大家熟知的蘑菇、羊肚菌、大型子实体和巨大马勃菌。

最新公布的真菌物种估计数量报道有72065种涵盖11个门7745个属。

新的真菌物种在不断的被描述，每年大概有2000种，根据真菌索引种类等级大约80-10000个真菌物种。

但是，这些物种只是目前分离和描述的，我们仍不确定到底有多少真菌种属还没检测到。

据Hawksworth估计还有100万种未被描述，Driver和Milner认为大概接近50万种与昆虫有关。

这看起来似乎大部分真菌物种生命循环的一部分在土壤环境中或与土壤环境有关。

它们在土壤中的作用极为复杂并且对于土壤生态系统十分重要。

然而，评估土壤中真菌的绝对数量和种类却十分困难，因为受分离和检测土壤真菌方法的局限，尽管相当的一些种类已经从土壤中分离出来并报道了。

至今没有土壤中物种数量的关键评估。

Gilman包括了700个物种，尽管这些只包括土壤稀释后非选择性培养基上生长的物种，并且排除了陆生的巨型真菌和植物病原菌。

许多物种包括在Barron、Domsch和Watanabe等编纂的书里。

Watanabe认为从土壤中分离出的真菌至少有1200种。

确切的检测一个土样中存在哪种真菌是一项很困难的任务，一个最主要的问题是大部分的物种不可培养。

这是一个众所周知的现象，事实上，评估显示，已知的真菌只有17%才可以在培养基中生长。

如果这个数字用在Wantanabe建议的1200种上面，那么土壤真菌应该有7000种左右。

另外，虽然一些土壤栖居真菌可以在培养基中生长，但是大多数情况下它们不能长出休眠结构，例如孢子，因此，只有营养菌丝可以用来详细分析。

一些更普通的土壤真菌培养方法将在后面提到。

传统的土壤真菌多样性的指标是土壤中含有的子实体的数量和变化。

就像前面提到的，真菌子实体变化巨大，例如巨型马勃菌通常直径一米或更大，而通常的蘑菇和蕈菌，细微结构只有几微米，例如许多子囊菌。

而且，尽管在土壤环境中可以检测出许多子实体，但是大部分土壤真菌是以休眠体（孢子）或者菌丝体的形式出现。

有很多文献提到个别土壤样品中真菌种类的数量，这些数据随土样不同变化巨大，报道的最高值是66900m/1g干土。

菌丝体和孢子可以从土壤中分离出来，但是如果样品或培养基中没有相关联的子实体，那么微生物的鉴定机会很困难，通常不可能。

功能和作用与土样中单一真菌相关的菌丝体数量是相当大的。

拿菌根真菌来说，单一的网络就可能覆盖植物根部系统的大部分。

拿自由生活的土壤真菌来说，传统的仙人圈是由标记在单菌丝微生物外围的一系列的子实体所构成。

通过分子生物学和遗传学研究鉴定得出的目前已知的最大的这种微生物是Armillaria bulbosa，并且已知在美国的密歇根州至少有15公顷。

后来一篇未经证实的报道称鉴定出更大的A.ostoyae在美国的华盛顿州有600公顷。

最近，经证实的报道称在Malheur国家森林发现了更大的覆盖880公顷的真菌。

在这种情况下，像仙女环这种真菌的生长和蔓延明显是菌丝体。

然而，边缘的的子实体产生大量的孢子，但是它们在蔓延和微生物生长中的作用却很少有人研究。

土壤中孢子在真菌繁殖中的作用在各个类群之间有所不同。

阻止油掌腐烂的灵芝，它们的繁殖被认为是通过连接掌的根部的菌丝生长。

但是，随后的研究对这个假定产生的质疑，他们认为可能是孢子形成了这种真菌繁殖的重要部分，即使在相对局限性的种群中。

在异担子菌中，菌丝生长和孢子繁殖都会发生在当地种群中，孢子繁殖在入侵管理森林的树桩时十分重要，根部的菌丝生长在林龄较大的已形成的自然森林中很重要。

Christensen描述了真菌的20种功能，其中最主要的一项功能是作为土壤中的主要降解者。

对于这种传统的生命循环是在土壤中的有机物上作为菌丝生长，因此导致在表面或者地下形成子实体。

许多土壤真菌还有其他的功能和相互关系，其中研究最广泛的是菌根。

菌根关系多变并且它们可能和植物直接共生，以帮助植物种子萌芽或者通过生态位排斥来阻止病原菌入侵。

真菌菌根的关系从极端的植物和真菌的自生关系到只在宿主植物组织细胞内表面寄生的内生菌根。

真菌菌根的关系特异性也是变化很大。

当许多菌根真菌可以和许多不同的宿主形成关系同时，其它的则是宿主特异性或宿主严格限制性的，例如红菇属。

另外，在一个单一的植物宿主根围可能供养着大量不同的菌根真菌。

土壤真菌也有很多其它的相互作用和关系，例如作为植物、节肢动物、线虫或者真菌类的病原体。

反过来，它们也可能是作为节肢动物和其他无脊椎动物的食物，或者被致病性的细菌攻击。

不管怎样，真菌在土壤中既以活跃的生命有机体存在，也以潜伏的繁殖体存在。

后者可能有它们与非土壤环境有关的基本的生命循环，土壤作为中间的储备。

其中虫霉真菌提供了一个例子。

这些是结合真菌，它们是许多节肢动物尤其是双翅目和同翅目的病原菌。

虫霉的孢子在节肢动物上发芽，然后菌丝侵入宿主。

被入侵的节肢动物有一种走向更高的植物表面的趋势，此时形成的真菌就通过吸器将死亡的节肢动物和植物结合在一起。

然后释放孢子，其中一大部分进入土壤，它们在遇到新的宿主以前依然是休眠状态。

因此，土壤真菌可能被叙述为可以活跃的自由生长、与其他微生物或休眠体密切相关的一系列大量的为微生物。

这些真菌如果产生子实体或者其他复杂结构就可以被常规的鉴定出来。

但是任意给定土样中假定出现的大量真菌却不能通过传统的技术鉴定出来。

分子技术由于形态学技术不能充分的确定和描述真菌，因此导致了分子方法的发展。

如今，分子技术已经变成了大多数发展史、分类学和鉴定研究的标准方法。

分子技术的发展大大加速了PCR的使用，反过来这也促进了分子技术在研究环境样品中的使用。

一般的环境样品，特别是土样，由于存在大量的自然物质（例如腐植酸、单宁和木质素相关的化合物），会干扰PCR反应和抑制扩增。

这些困难已经被起始DNA提取方法的发展和优化克服了。

PCR最简单的经验方法就是利用其反应对低浓度DNA的超常敏感性来稀释样品到一定的浓度，此时抑制因素的浓度不再影响扩增。

但是如果起始样本DNA本身就不高的话，这种方法就不太实用了。

在这种情况下，起始的DNA提取往往要使用额外的试剂来去除抑制物。

目前有许多这样的方法，但是，大多数或者涉及包含和DNA选择性结合的成分，例如十六烷基三甲基溴化铵，或者包含额外会排除特意性等级的抑制剂，例如去除多酚类的聚乙稀聚吡咯烷酮PVPP。

在极端情况下，可能必须使用两种方法相结合的DNA提取步骤，或通过DNA亲和柱来纯化。

真菌的分子学研究大部分集中于核糖体RNA基因簇上。

但是真菌的机构单元由三个核糖体RNA亚基，内部转录间隔区和基因间隔区构成。

在真菌细胞核中有大量重复的基因簇，因此提供了很好的目标区域。

通常，亚基上的基因簇包含一些极度保守的序列，这些序列可以用来设计各种各样的特异性PCR引物。

这些特异性引物包括一些增强真菌特异性的或者特别是对于囊真菌或者担子菌的。

所以，使用这些引物可以从混有其他微生物DNA的样本中把真菌序列给扩增出来。

这在研究地衣真菌研究领域被广泛的采用，真菌DNA可以在含有污染海藻和细菌DNA的情况下被扩增出来。

这些引物使得真菌DNA从土壤DNA提取物中扩增变得可能，然后通过DDGE、SSCP等技术产生种或者属的图谱。

有大量的研究在真菌分类时使用rRNA基因簇，大多数情况下，亚基因的保守序列可以用来研究分类和亲缘关系。

多变间隔区也已经被用来研究种内和种间的关系。

可是，我们都知道一个多变的关系和间隔区序列变化程度在不同的真菌之间变化很大。

例如在内部转录间隔区的种内变化在一些青霉属种内是1-2%，纹枯病菌内则高于40%。

但是，这些序列的差异并没有阻止一系列PCR引物的发展，它们可以从特殊种和属内扩增rDNA。

这些引物被广泛的应用于土壤真菌和植物真菌菌根的研究。

生态学研究分子技术应用广泛的一个土壤真菌学领域就是真菌生态学，特别是菌根真菌。

PCR引物可以用来从菌根材料中扩增真菌DNA，这种方法已被用来比较不同根部和土壤环境下的真菌多样性。

使用的方法包括总扩增真菌ITS区域的酶切后获得的多态性分析和种类特异性引物的开发。

其中的一项基于ITS的RFLP技术的研究，比较了不同森林系统下的土壤真菌多样性。

在古老的和管理良好的森林之间，子实体的物种多样性变化很大。

但是，分子学方法显示这两种条件下检测出的物种大量相似，导致人们认为造林方法可能对子实体产量的影响大于种群多样性，尽管不清楚这种情况是否会持续很长一段时间。

其它的生态学研究观察了土壤中子实体和物种多样性的关系。

有一项研究观测了地上大量可见的物种丰富度，像子实体，和那些通过分子学方法检测的地下的结果。

研究发现，当一些物种（例如红菇属）只在地上子实体中出现时，其他的只在地下菌丝体中才能发现。

所有的这些和相似的研究似乎说明分子方法似乎不支持基本的调查和观察结果。

这在灌木菌根的研究中也得到了证实，其中圆叶风铃草共栖提供了一个例子。

在这种情况下，土壤中两种丛根菌根物种孢子的出现被作为风铃草潜在的内生植物菌群。

但是，相近的根部用分子学方法分析却得到三个物种。

在分析这种类型的结果时要特别的小心。

PCR的一个基本原理就是当过量引物出现时进行竞争性杂交。

在混合DNA物种的样品中也可能发生相似的情况，因此PCR可能趋向于扩增最优势微生物的DNA。

单个真菌物种的丰富并不能指示真菌的生长或活性，可能指示那些隐藏或者休眠的形式。