沙门氏菌和志贺氏菌的检测

H抗原：为不稳定的蛋白质抗原，加热或用乙 醇处理均被破坏。沙门菌H抗原有两个相,第一 相特异性较高称特异相,用小写英文字母a、b、 c表示，直至z，z以衙用z加阿拉伯数字表示， 如z1、z2、z3等，第二相抗原为沙门菌共有， 称非特异相，直接用1、2、3表示。同时有第 一相和第二相H抗原的细菌称为双相菌，仅有 一相者称单相菌。H抗原是定型的依据，其刺 激机体产生的抗体以IgG为主，与相应的抗血 清呈絮状反应。
沙门氏菌和志贺菌检测
熊长辉
概述 肠道感染细菌
肠道感染细菌是通过粪-口传播途径进行传播的一 类细菌。 主要包括 肠杆菌科细菌、霍乱弧菌、副溶血性弧
菌、幽门螺杆菌等。
肠杆菌科 中与医学有关的包括： 埃希菌属、志贺
菌属、沙门菌属、变形杆菌属等。
肠杆菌科共同特性
相似的形态染色 G 小杆菌，有鞭毛(痢疾杆菌外) 菌毛，某些有荚膜，无芽胞
斜面红色、底层黄色，出现部分黑色或全部黑 色 斜面红色、底层黄色，无黑色 斜面、底层均黄色，出现部分黑色或全部黑色
除沙门菌外，变形杆菌、柠檬酸盐菌、志贺菌 等也可出现上述反应。 • 吲哚试验：阴性
志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖， 不产生H2S。 大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不 产生H2S 。 沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖、蔗糖，大多数产生 H2S ，多数产气。 下面照片所示2-3-4，可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏 菌？
1）正常凝集价 正常人由于隐性感染或预防接种，血清中通常可含 有一定水平的凝集抗体，正常的凝集价可因不同地区而有差异 一般情况下，伤寒沙门菌O抗体的凝集价应在1∶80以上，H抗体 凝集价在1∶160以上，引起副伤寒沙门菌H抗体凝集价在1∶80以 上才有诊断意义 2）动态观察 有时单次效价不能定论，可在病程中逐周检查。若效 价逐次增加或恢复期效价比初次≥4倍者有意义
V-W变异：是指沙门菌失去Vi抗原的变异。初次分离得到的具有 Vi抗原、O抗原不凝集的沙门菌称V型菌；Vi抗原部分丧失，与O 抗原血清发生凝集又可与Vi抗血清凝集者称VW型菌。 Vi抗原完 全丧失，与O抗原血清发生凝集又与Vi抗血清不凝集者称W型菌。 V-W变异的过程是V型菌经人工培养，逐渐丧失部分Vi抗原而成为 VW型，进而丧失全部Vi抗原而成为W型菌。
2）食物中毒（急性胃肠炎）：由鼠伤寒沙门菌、猪霍乱 沙门菌、肠炎沙门菌引起，有发热、恶心呕吐、水样泻，严 重者致脱水、休克、肾衰而死亡（主见于婴儿、老人等）， 但，大多2~3天自愈。
3）败血症 ：常由猪霍乱沙门菌、丙型副伤寒沙门菌、 鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等引起。有高热、寒战、贫血等 严重症状。多见于儿童及免疫力低下者。
5.变异性
S-R变异:自临床标本初次分离的菌株一般都是光滑型，经人工培 养，传代后可逐渐变民粗糙型菌落。此时菌体表面的特异多糖抗 原丧失，在生理盐水中可出现自凝。 H-O变异：是指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异 位相变异：具有双相H抗原的沙门菌变成只有其中某一相的单相 菌，称位相变异。在沙门菌血清学分型时，如遇到单相菌，特别 是只有第Ⅱ相（非特异相）抗原时，需反复分离和诱导出第Ⅰ相 （特异相）抗原方可作出鉴定。
生化反应
初步鉴别：三糖铁琼脂
乳糖:蔗糖:葡萄糖=10 : 10 : 1 以酚红作指示剂
当待检菌发酵乳糖或蔗糖时，产酸量多，使整个培养 基均呈黄色；如仅发酵葡萄糖，则产酸少，斜面由于 细菌生长分解蛋白胨而释放氨，酚红显碱性红色、而 底层黄色 细菌对培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还 原作用，生成硫化氢。硫化氢遇硫酸亚铁或柠檬酸铁 铵产生不溶性黑色硫化亚铁。
（A-F）对沙门菌分离株进行分群。95%以上的沙门菌临 床分离株都属A-F群，多价抗血清凝集后再用分别代表 每一个O血清群的单价因子血清定群。O分群之后再用H 因子血清检查第一相和第二相H抗原，综合O、H及Vi因
子血清的检查结果，判断血清型。
鉴定与分型——血清型分型
• 注意：试验时与多价血清不凝集时，可在玻璃试管内 用生理盐水将细菌制成尝菌液，放入沸水中15~30min，
抗原构造
• 菌体抗原（ o ）：不被乙醇、 0.1% 石炭酸所破 坏。与特异性抗血清呈颗粒状凝集，形成慢， 不易摇散。现已知有50多种，多数沙门菌含有 两种以上的O抗原，有的O抗原是一种菌独有的， 有的是几种菌共有的，凡含有共同特异性抗原 成分的血清型归为一个群，可将沙门菌化分为 42群，按A-Z排列，Z以后的顺序以O51-O67表示。 引起人类沙门菌病的95%以上都在A-F 6个群内。
表面抗原：在沙门菌属中已被证实的表面抗原有Vi抗原、 M抗原、5抗原三种 • Vi抗原：是一种不耐热的酸性多糖聚合物，加热60℃30分 钟或经石炭酸处理即被破坏，经人工培养基传代后也易失
去。新分离的伤寒及副伤寒沙门菌常带有此抗原。Vi抗原
位于菌体的最表层，有抗吞噬及保护细菌免受相应抗体和 补体的溶菌作用。Vi抗原存在时可阻止O抗原与相应抗体 发生凝集，故在沙门血清学鉴定时应加以注意，需事先加 热破坏Vi抗原之后，O抗原才得以与相应的O抗血清发生凝
生物学特性
1.形态
两端钝圆的革兰氏阴性杆菌， （0.4-0.9）µm ×(1-3)µm，无
芽孢，周生鞭毛，一般无荚膜，
少数有包膜。 光滑型的细菌大小均匀，粗
糙型则大小不一，长短不一。
培养和生化反应
• 兼性厌氧，最适生长温度35～37℃，最适生长 PH为6.8～7.8.本菌属对营养的要求不高，在 普通营养琼脂上生长的菌落为圆形、光滑、湿 润，半透明，边缘整齐的菌落，有时可出现粗 糙型的菌落。在肠道选择性培养基上菌落小至 中等，透明或半透明，乳糖不发酵，与志贺菌 的菌落相似，有些能产生硫化氢的菌株，在SS 琼脂上形成中心黑色的菌落。
血清学诊断
• 用已知伤寒、副伤寒的O、H抗原，检测受检血清中有 无相应的抗体的半定量试管内凝集试验，称为肥达反
应。
• 方法 将受检血清用生理盐水作倍比稀释，每个稀
释度需作出努力个复管，分别加入等量的伤寒沙门菌O、 H抗原及副伤寒沙门菌甲、乙、丙的H抗原进行试管内 凝集，凡血清最高稀释度出现明显凝集者为凝集将价。
甲型副伤寒 K
乙型副伤寒 丙型副伤寒 猪霍乱沙门菌 伤寒沙门菌 其他沙门菌
A A A A A A
+ + + + -+
-/+
++ ++
K K K K K
-/+ +/+
鉴定与分型——血清学分型
2.血清学分型 用抗血清对所分离菌种的O抗原、表面 Vi抗原，第一相和第二相H抗原进行凝集试验（O：Vi：
第一相H：第二相H）。多数实验室先用多价O抗血清
冷却后再次做凝集试验。因Vi抗原能阻断O凝集反应，
而煮沸处理能破坏菌体表面的Vi抗原。仅出现单相H抗 原（第一相或第二相）时，需用位相分离的方法诱导 出另一相抗原后再进行检查。
鉴定与分型——Vi噬菌体分型
标准的Vi噬菌体共有33型，该法可用于流行病 学调查和追踪传染源，常在一些特殊的参考实验室内 进行，一般医院的微生物实验室不列为常规检查项目。
鉴定与分型——生化鉴定
疑为沙门菌的可疑菌落可用手工或商品生化反应进行
生化鉴定，常用三糖铁(TSI)琼脂和赖氨酸琼脂来初步鉴定。
本菌在TSI上典型的生化模式为：碱/酸，葡萄糖产气，硫 化氢阳性（K/A++）。少数菌株为乳糖发酵型，呈（A/A）， 这些菌株的硫化氢往往阴性。在赖氨酸铁琼脂上的典型生 化模式为K/K和硫化氢阳性，但亦存在赖氨酸和硫化氢阴性 的菌株（副伤寒A沙门菌）。初步反应疑为沙门菌的菌株必 须经全面生化反应证实和血清学分型后才能发出报告 。
粪、尿、可疑食物
分离培养
37 ℃ 18~24h
可疑菌落
37 ℃ 18~24h
增菌培养
(SF、CN、TT)
（SS、EMB、MAC、血平板）
初步鉴定
（涂染检、KIA、MIU、IMViC 等生化反应、A-F多价血清凝集） 37 ℃ 18~24h
最终鉴定
肠道杆菌系统生化反应 单价因子血清定血清型
检验方法
集。带Vi抗原的沙门菌亦可用Vi噬菌体进行分型，有助于
流行病学调查和追踪传染源。
M抗原：粘液抗原，在菌型鉴定上无特殊 意义。 5抗原：
4.抵抗力
• 不强，加热60℃1h，或65℃15~20min即 被杀死。在水中能存活2~3周，在粪便中 可存活1~2月。对胆盐和煌绿等染料有抵 抗力。因此可用于制备沙门菌的选择培 养基。
沙门菌属细菌的初步鉴定
KIA
斜面 底层 产气 H2S
MIU 触酶 氧酶
+ -+ -+ -+ -+ -+ -+ + + + + + — — — — — —
硝酸盐 诊断血清凝集 还原 + + + + + +
A~F多价+ A群+ A~F多价+ B群+ A~F多价+ C群+ vi+ A~F多价+ C群+ A~F多价+ D群+ vi+ A~F多价+ 肠炎+
（1）血液和骨髓：血液5ml或骨髓液0.5ml胆汁葡萄糖 肉汤或胰化蛋白大豆肉汤中，35-37℃孵育，若有生
长（多在2~4日内出现）则移种至血琼脂平板和SS培养 基中。 （2）粪便或肛拭：最好作床边接种，或用卡-布（CaryBlair）运送培养基。 （3）尿液和体液：无菌采集的中段尿、胆汁、脑脊液、 胸腹水等经3000r/min离心沉淀后接种于增菌液、血琼 脂和肠道选择培养基。 （4）食物等固体物质：磨碎后加10ml无菌生理盐水混匀， 接种于增菌液和肠道选择培养基。