免疫检验 大题

杂交瘤技术

【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）选择性培养基的作用，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。（一）小鼠骨髓瘤细胞

理想骨髓瘤细胞的条件：①细胞株稳定，易于传代培养；②细胞株本身不产生免疫球蛋白或细胞因子；③该细胞是HGPRT或TK的缺陷株；④能与B细胞融合成稳定的杂交瘤细胞；

⑤融合率高。

目前最常用的是NS-1和SP2/O细胞株

（二）免疫脾细胞

多采用与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c小鼠；免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法。若抗原微量，可用脾脏内直接注射法进行免疫。细胞性抗原不需加佐剂，可溶性抗原需加完全弗氏佐剂。

（三）细胞融合

是产生杂交瘤细胞的中心环节。一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG作细胞融合剂，浓度30~50 %之间，基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:2 ~ 1:10比例混合，加入PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在2min以内，再加入培养液缓慢稀释PEG融合液，直至失去融合作用，融合细胞形成具有两个或多个核的异核体，最终产生杂交细胞。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养

肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条为生物合成途径，可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另一条为替代途径，叶酸代谢受阻时，细胞通过HGPRT和TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合成DNA。HAT培养液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），经HA T培养液筛选后，只有具备两亲本细胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。

凝集反应与沉淀反应有何异同

一、相同点：

①都是抗原抗体的特异性反应；②都分为两个阶段，抗原抗体特异性结合和出现可见复合物阶段；③有相同的反应机制和影响因素。

二、不同点

稀释对象抗体抗原

结果出现凝集块出现沉淀物

时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术相结合而建立起来的一种新型非放射性微量分析技术。它具有灵敏度高、发光稳定、荧光寿命长、自然荧光干扰少、标准曲线范围宽等优点，已在临床检测中广泛使用。

【基本原理】

1、时间分辨：通常各种组织、蛋白或其他化合物，在激发光照射下都能发出一定波长的自发荧光，这些荧光是非特异性的，会干扰荧光免疫测定，影响其特异性和灵敏度，但它们的荧光寿命常较短（1~10 ns），最长不超过20ns。而镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10~1000 μs），因此，在检测时可在短寿命本底自发荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特异性荧光信号，可有效降低本底荧光的干扰，故称为时间分辨。这是本技术具有高灵敏度的原因之一。

2、stokes位移：即激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素stokes位移大（通常为273nm），激发/发射光谱不重叠，用简单的滤光片就能把激发光和发射光分开，可消除激发光散射引起的干扰。

3、发射光谱和激发光谱：镧系元素发射光谱带较窄，多在613nm±10nm，利用615nm±5nm 的滤光片只允许此波段的发射光通过，可排除其余波长的荧光。生物样品的本底荧光波长通常在350~600 nm，故在615nm±5nm波段内，来自生物样品的荧光干扰极少，可有效降低本底荧光。

镧系元素的激发光谱则较宽，通常为300~350 nm，非常有利于增加激发能，提高检测的灵敏度。

4、荧光标记物的相对比活性：测定Eu3+螯合物发射荧光采用的激发光源为脉冲氙灯，其工作频率为1000次/秒，由光导纤维闪光管的控制系统。

比活性是指单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。在测量时间内，Eu3+可被反复激发，每次激发后，他可很快由激发态回到基态，发射荧光；然后又可被重新激发，如此每秒可有1000次激发，这就大大提高了荧光标记物的比活性。

5、信号增强：免疫反应完成后，形成Eu3+标记的抗原抗体复合物，其在弱碱性溶液中的激发荧光信号较弱，加入酸性增强液可使Eu3+标记的抗原抗体复合物的pH降至2~3，Eu3+

从复合物上完全解离，游离的Eu3+可被增强液中的螯合剂所螯合，在协同剂等成分的作用下，与增强液中的β-二酮体生成以Eu3+为核心的保护性胶态分子团，它是具有高强度荧光的稳定螯合物，信号的增强效果可达上百万倍。

（二）标记物和标记方法

1、标记物：用于本技术测定的标记物是镧系元素，其中铕（Eu3+）和铽（Tb3+）的荧光寿命特别长且荧光强度高，多用这两元素作为标记物，其中Eu3+最为常用。

镧系元素在游离状态下的荧光相对较弱，与螯合剂如β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）等形成螯合物后，可使荧光强度增强。螯合物的荧光寿命与配体有关。

2、标记方法：需利用具有双功能基团的螯合剂，一端与镧系元素离子结合，另一端与抗原或抗体蛋白分子上的氨基结合，形成镧系元素离子-螯合剂-抗原（或抗体）复合物。常用的双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等，此法可允许每个蛋白质分子上标记多个Eu3+而不影响其生物学活性和稳定性。

螯合剂可先螯合Eu3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合Eu3+（两步法）。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子蛋白载体（牛血清白蛋白，多聚赖氨酸等）连接，再标记Eu3+。

（三）方法类型

1、双抗体夹心法：将待检抗原与固相抗体结合，再与Eu3+标记抗体结合，形成固相抗体- 待测抗原- Eu3+标记抗体复合物，在酸性增强液的作用下，复合物中的Eu3+从免疫复合物上解离并形成螯合物，在340nm激发光照射下，游离出的Eu3+螯合物可发射613nm的荧光。经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原的含量。

2、固相抗体竞争法：将待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争结合，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液，测定荧光强度，所得荧光强度与待检抗原含量负相关。

3、固相抗原竞争法：与固相抗体竞争法类似，只是第一步改成将待检抗原和固相抗原竞争性结合定量的Eu3+标记抗体。

（四）方法评价

1、优点：灵敏度高，检出下限为10^-18mol/L（普通荧光免疫计数仅为10^-8mol/L）。分析范围宽，可达4~5个数量级。标记结合物稳定，有效使用期长。测量快速，易于自动化。本法在灵敏度、稳定性和测量自动化程度等方面均可与RIA相媲美，是超微量物质分析方法中最有发展前途的一项技术。

2、缺点：易受环境、试剂和容器中镧系元素离子的污染，使检测本底增高。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

【基本原理】把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体