染料法荧光定量标准曲线

标准曲线的重要性

对于染料法定量PCR而言，标准曲线是一个非常重要，甚至可以说必不可少的一个要素。通过标准曲线我们可以直观的判断以下重要信息：

1.qPCR反应体系是否有效，是否能够分辨初始模板浓度的不同

如果标准曲线没有线性关系，则说明反应体系没有准确的模板浓度识别能力，检测无效2.qPCR反应体系对模板浓度的有效识别范围

理论上来讲，只有待测模板Ct值位于标曲线性范围内，检测才有效

3.qPCR反应的扩增效率有多高，能否使用2-△△Ct进行相对定量分析

如果扩增效率大于0.9，可粗略使用2-△△Ct进行分析；

如果扩增效率太低，需要对计算公式进行矫正之后才能计算。

总而言之，标准曲线是判定定量体系、定量结果有效性的必须指标！影响标准曲线的因素有很多：试剂、仪器、反应程序、引物序列、反应体系引物浓度等等。每当这些因素更改之后都应重新绘制标准曲线。

标准曲线的制作方法

1.选择并制备标准品

标准曲线是使用“标准品”进行qPCR获得的。正确的标准品选择对标准曲线制作至关重要。根据制作标准曲线目的分类，标准品选择依据如下：

如果需要做绝对定量：

绝对定量标准品必须具有已知的拷贝数浓度，可用作标准品的样品包括

A.扩增产物

B.将扩增产物克隆到载体后得到的质粒

选择其中一种（推荐后者，扩增产物极易产生污染，慎用），将产物纯化后测定绝对浓度，然后根据分子量计算摩尔浓度或拷贝数单位。

如果仅需使用标曲来判断反应有效性：

有效性判断无需标准品的拷贝数浓度，可用作标准品的样品包括

A.扩增产物

B.将扩增产物克隆到载体后得到的质粒

C.基因组、cDNA等

2.标准品梯度稀释

使用灭菌蒸馏水或者专用稀释液将制备好的标准品做数个10倍梯度稀释，取其中4-6个梯度样品进行上机检测。需要注意以下三点：

A.因标准品类型不同，最佳稀释倍数大不相同。如使用cDNA作为标准品，推荐稀释梯度为1:10，1:100，1:1000，加上原有不稀释样品，使用共计4个浓度梯度进行上机检测；如使用扩增产物或质粒作为标准品，稀释倍数可能需要达到1:10000-1:100000，甚至更高。初次进行实验，可将稀释梯度做宽一些，挑取下机数据中具有线性关系的部分进行标曲绘制。

B.样品稀释应按照1+9的方式在上一个稀释梯度样品上顺序进行，如1:100稀释梯度应在1:10稀释梯度上稀释10倍制备，而不应使用1+99的方式在原始样品上进行；稀释样品的过程中切勿使用移液器吹打，应在移液完成后闭管V otex+离心，可以有效避免气溶胶污染。

C.样品现用现稀释，用完丢弃，不可存放。

3.稀释样品上机检测

使用步骤2稀释好的一系列标准品进行上机检测，注意以下事项：

A.必须进行无模板阴性对照反应（模板用灭菌蒸馏水代替），可以根据这个反应的Ct值（如果体系存在污染或非特异性扩增时，也会有Ct值）确定标准曲线最大Ct值范围。

B.加模板时按照“无模板阴性对照--高稀释倍数样品--低稀释倍数样品”的顺序进行，可以有效避免气溶胶污染产生。

C.每个样品设置三个复孔

D.推荐模板体积不小于2 μl，移液的准确线对于标曲线性至关重要。

4.数据有效性筛选

反应结束后，根据如下步骤选择有效数据

A.根据融解曲线判断：剔除所有融解曲线非单峰的样品以及数据。一般而言稀释倍数越大的样品非特异性扩增产生的可能性越大。

B.根据无模板阴性对照判断：如果无模板阴性对照的融解曲线与其他标准品一致，则暗示扩增体系存在污染，当前体系最大有效Ct值为无模板阴性对照Ct值-3，剔除所有Ct值大于这个值得样品及数据；如无模板阴性对照无Ct值或者融解曲线显示扩增产物为引物二聚体，则无需进行以上操作。

C.根据相邻稀释梯度3.6>△Ct值>3.2的原则（表示扩增效率约为0.9-1.1之间），对原始Ct值数据进行过滤：模板浓度太高（低稀释梯度）容易导致△Ct值低于 3.2，模板浓度太低（高稀释梯度）容易导致△Ct 值高于3.6，根据上述原则选择稀释梯度△Ct间隔均匀并且不低于3.2不高于3.6的区域进行标区绘制，剔除间隔不均匀的稀释梯度。如中间区域间隔不均匀，则表示样品稀释或者模板加样误差太大，应重新实验。

数据筛选完毕后，应得到如下形式的融解曲线和扩增曲线：

划取合适的阈值，取Ct值后制作标准曲线。

5.使用Ct值和Log[N0]绘制标准曲线

A.使用各稀释梯度Ct值平均值作为纵坐标

B.使用如下值作为横坐标：

如果标准品有确定的拷贝数或摩尔浓度单位，选取各稀释梯度的Log10(拷贝数)或Log10（摩尔浓度）作为横坐标；

如果标准品没有确定的拷贝数或摩尔浓度单位，选取各稀释梯度的Log10(稀释倍数)作为横坐标。如有效稀释梯度为1:10，1:100，1:1000，1:10000，则对应横坐标为Log10(1/10)，Log10(1/100)，Log10(1/1000)，Log10(1/10000)，即-1，-2，-3，-4。

使用线性拟合工具拟合后的标准曲线即其方程形式如下：

一个合格的qPCR检测体系的标准曲线应满足如下条件：

1.-3.6<斜率<-3.2，表示扩增效率位于0.9-1.1之间

2.R2>0.99，表示线性关系良好，定量准确

6.写在最后

从标准曲线可以得知很多有用信息，以上图为例，我们可以得知：

1.检测体系有效Ct值范围：10-34。如果定量其他样品时，只要Ct值在这个区域内，就表示检测有效。如果Ct值超出这个范围检测无效，应调整样品浓度重新定量。

2.检测体系扩增效率：标准曲线斜率和扩增效率之间存在函数关系，扩增效率e = 10[-1/标曲斜率] -1，进而判断2-△△Ct计算是否有效。

3.判断所用试剂的好坏：好的qPCR试剂应该是线性关系好、扩增效率高，而不应该以Ct 值大小来判断。

4.如果标准品具有确定的拷贝数单位，还可通过标准曲线得知体系的检测灵敏度等指标。

严格来讲，每一对引物的每一个反应条件都应优先建立相应的标准曲线，它是判断我们获得的Ct值否是有意义的唯一途径！