野外放归大熊猫和圈养大熊猫肠道正常菌群的研究

收稿日期:2004202225

3通讯作者

文章编号:049020756(2004)0621276204

野外放归大熊猫和圈养大熊猫肠道正常菌群的研究

谭　志1,鲍　楠1,赖　翼1,张和民2,李德生2,刘成君1,3

(1.四川大学生命科学学院,成都610064;2.中国保护大熊猫研究中心,四川卧龙623006)

摘要:对四川卧龙中国保护大熊猫研究中心1只放归亚成体大熊猫和3只圈养亚成体大熊猫

肠道正常菌群的种类、数量和分布情况进行了比较研究,结果鉴定出17种细菌,发现放归大熊

猫和圈养大熊猫肠道优势菌群均为肠杆菌、肠球菌和乳杆菌.与圈养大熊猫相比,大熊猫放归

野外后,肠道菌群中的肠球菌增多,肠杆菌和乳杆菌的数量有所下降,芽孢杆菌和酵母菌的检

出率增大.

关键词:放归大熊猫;圈养大熊猫;肠道菌群

中图分类号:Q93 文献标识码:A

为更好地保护大熊猫这一中国特有的濒危物种,2003年7月四川卧龙中国保护大熊猫研究中心启动了大熊猫野外放归工程,这项工程旨在将人工圈养的大熊猫放归大自然,补充野生大熊猫种群数量,改善野生大熊猫遗传的多样性,同时进一步壮大圈养种群,达到长期保存这个物种的目的,这项实验的关键在于要提高圈养大熊猫在野外的存活率.研究表明,大熊猫趋于濒危的主要原因之一是疾病致死,在致死大熊猫的各种疾病中,以肠道疾病最为严重[1].因此,研究放归大熊猫和圈养大熊猫的肠道菌群的种类和分布对预防和诊断大熊猫胃肠道疾病,提高野外放归的存活率具有十分重要的意义.

目前,圈养大熊猫的饲料主要由高蛋白高热量的精饲料构成,食谱丰富,营养水平高,而放归后大熊猫的主食将变为以竹子为主的高纤维低热量野生植物,食物结构发生很大转变.研究表明,大熊猫易因食物结构的转变而发生胃肠道疾病,并影响其生长发育,甚至造成死亡[1,2].本实验的目的就是要研究放归大熊猫和圈养大熊猫的肠道菌群变化,搞清变化规律,从而为放归大熊猫饲料的合理搭配,采取药物预防食物结构转换期肠道内病原菌的过度繁殖等措施提供重要的科学依据.

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　实验动物　亚成体大熊猫4只,分别为“祥祥”、“林蕙”、“林阳”、“福福”,由四川卧龙中国保护大熊猫研究中心饲养.其中熊猫“祥祥”于2003年7月8日放归野外放养场.另三只大熊猫为圈养,大熊猫“林蕙”于2003年10月12日被租借到泰国清迈.

1.1.2　培养基　根据已报道的肠道常见菌,选择15种选择性培养基(见表1)进行培养.培养基配方参考

《微生物培养基的制造与应用》[3]、《临床厌氧菌检验手册》[4]、熊德鑫(1986)[5]方法.其它普通培养基和生

化实验培养基均按常规方法制备.

1.1.3　试剂和溶液　革兰氏染色液,硝酸盐还原试剂,MR 试剂,V P 试剂等均按常规方法配制.

1.2　方法

1.2.1　采样　粪样采集从2003年7月7日开始,到目前共采样10次,分别在7月7日,7月8日,7月162004年12月

第41卷第6期四川大学学报(自然科学版)Journal of Sichuan University (Natural Science Edition )Dec.2004Vol.41　No.6

日,7月23日,8月1日,8月15日,9月14日,10月15日,11月15日,12月15日.用于厌氧培养的大熊猫新鲜粪便即刻放入装有10mL 厌氧运送培养基的厌氧转送管内[6].样品立即于当日开始进行细菌培养,计数,鉴定等工作.

表1　培养基与培养对象

培养基

培养对象培养基 培养对象 肠杆菌培养基(MCA )

肠杆菌科(Enterobacteriaceae )优杆菌培养基(ES )优杆菌属(Eubacterium )肠球菌培养基(EC )

肠球菌(Enterococci )乳杆菌培养基(Cd )乳杆菌属(L actobacillus )葡萄球菌培养基(Sp )

葡萄球菌属(S taphylococcus )梭菌培养基(Sd )梭菌属(Clost ridium )沙鲍氏培养基(Sb )

酵母菌(Yeasts )消化球菌培养基(Ps )消化球菌(Peptococcus )芽孢杆菌培养基(BA )

芽孢杆菌属(B acillus )双歧杆菌培养基(BLB )双歧杆菌属(Bif idobacterium )沙门氏菌培养基(HE )

沙门氏菌属(S al monella )韦荣氏球菌培养基(Vs )韦荣氏球菌属(V eillonella )耶尔森氏菌培养基(S.S )耶尔森氏菌属(Yersinia )空肠弯曲菌培养基(CO )空肠弯曲菌(V ibrio Jeiuni )

类杆菌培养基(Bds )类杆菌培养基(B acteroide )1.2.2　分离纯化、鉴定和计数　按检测对象的不同,分别在不同温度下进行需氧或厌氧培养[7](厌氧培养采用碱性焦性没食子酸法和姚伟邦等方法[8]进行培养).对分离的细菌纯培养物按伯杰氏系统鉴定手

册和《常见细菌系统鉴定手册》[9]鉴定到属、种,并计数菌落数,用菌落形成单位(CFU )表示.

2　结果

2.1　肠道菌群的种类及分布

对选择性培养基中出现的菌落进行细菌鉴定后共发现17种细菌.实验结果表明,圈养大熊猫和放归大熊猫肠道正常菌群中优势菌群为肠杆菌,肠球菌和乳杆菌,其中埃希氏大肠杆菌的检出率最高,为100%,其次是粪链球菌、乳杆菌及产气肠杆菌,检出率分别为97.2%、88.9%及72%.其它细菌的检出率较低,依次为小肠结肠炎耶尔森氏菌、葡萄球菌、芽孢杆菌、普通变形杆菌、肠炎沙门氏菌、酵母菌、双歧杆菌、空肠弯曲杆菌、小韦荣氏球菌、脆弱类杆菌(见表2).优杆菌、消化球菌、梭菌等未在受试粪样中检出.

表2　卧龙放归大熊猫和圈养大熊猫粪便正常菌群检测结果

细菌种类3细菌数量(Log10n /g )检出率(%)放归大熊猫圈养大熊猫放归大熊猫圈养大熊猫

17.9±0.28.2±0.2100100

28.0±0.47.4±0.210096.1

37.0±0.77.9±0.29088.5

4 6.6±0.

5 6.8±0.37069.2

5 6.7±1.0 6.7±0.55053.8

6 6.3±0.6 6.5±0.84038.5

7 6.8±0.67.1±0.76023

8 6.4±0.7 6.0±0.63026.9

9 6.7±0.6 6.4±0.63026.1

10 6.4±0.2 6.3±0.74015

11 6.3±1.4 6.2±0.82019.2

12— 6.5±1.1015.4

13— 6.8±1.307.7

14— 6.90 3.8

31:埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli );2:粪链球菌(S t reptococcus f aecalis );3:乳杆菌(L actobacillus sp.);4:产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes );5:小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica );6:葡萄球菌(S taphylococcus sp.);7:芽孢杆菌(B acillus sp.);8:普通变形杆菌(Proteus vulgaris );9:肠炎沙门氏菌(S al monella enteritidis );10:酵母菌(Yeasts );11:双歧杆菌(Bif idobacterium );12:空肠弯曲杆菌(Cam pylobacter jejuni );13:小韦荣氏球菌(V eillonella parvula );14:脆弱类杆菌(B acteroides f ragilis )

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