蛋白质定量与定性分析报告

蛋白质定量分析与定性分析报告

此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。

1.蛋白质定量分析

蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。蛋白质定量分析的方法有：280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA（二喹啉加酸）检测法、疏基测定检测法。

1.1280紫外吸光比色法

这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。

如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm 有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如：蛋白质浓度（mg/l）=1.45×A280-0.74×A260。蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。较为精确的公式为：

ε(280) (M-1 cm-1)= (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).

1.2经典Bradford与Lowery检测法

1.2.1 Bradford检测法

这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm 的光吸收值大小计算蛋白的含量。

蛋白质与色素结合反应很快，约在2min左右的时间内达到平衡，在室温1h之内是稳定的。在0.01~1.0mg蛋白质/ml范围内，蛋白质含量与OD595值成正比。

这种反应快速而敏感，几乎没有蛋白质损失，但是对各种纯化蛋白质反应不同，用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性，灵敏度

在25ug/ml~200ug/ml。下图为用Bradford检测蛋白质含量与吸光度曲线。

1.2.2 Lowery检测法

这一标准、快速的蛋白质定量分析检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除。原理是，蛋白质在碱性条件下与双缩脲试剂中的Cu2+形成络合物。由于蛋白质含芳香族氨基酸残基，生成的络合物可还原Folin试剂中的磷钼酸和磷钨酸而产生钼酸和钨蓝复合物，该复合物显蓝色，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。该蓝色复合物在745~750nm处有最大的吸收峰，可根据750nm的光吸收值计算蛋白质的含量。

该法灵敏度高，为5ug/ml~100ug.ml，但耗时长，干扰物质多，使蛋白质发生不可逆变性。

下图为Lowery检测蛋白质含量与吸光度的关系曲线。

1.3 BCA（二喹啉甲酸）检测法

在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。

1.4巯基测定检测法

含巯基化合物可以与DTNB（Ellman试剂）反应，断裂DTNB

的二硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸（NTB-），若在中性或碱性pH条

件下的水中可以离子化，生成NTB2-二价阴离子。这种NTB2-离子呈现黄色。这个反应迅速且定量，加入1摩尔的巯基可以释放1摩尔的NTB。通过测定在412nm可见光吸光度就可以定量NTB2-，进而计算巯基化合物含量（如谷胱甘肽GSH），或测定蛋白质上巯基基团的数目。

2.蛋白简单定性（分子量）

蛋白质分子量的简单定性是确定是否有蛋白质存在以及存在何种蛋白质，主要方法有：SDS-PAGE、质谱（ESI-MS）、动态弹性光散射、沉降平衡超速离心、排阻层析（分子筛）。

2.1SDS-PAGE

SDS-PAGE法测蛋白质的相对分子量：带电颗粒在电场中的迁移主要受三个因素的作用，即场强、颗粒本身的电荷及分子形状。

因此一般电泳无法直接测定蛋白质的分子量。加入变性剂SDS后，蛋白质中的氢键和疏水键被破坏，蛋白质变性肽链伸展且蛋白质所带电荷被SDS的负电荷覆盖，使蛋白质所带负电荷远超过本身所有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，同时还加入巯基乙醇破坏蛋白质的二硫键，使蛋白质几乎成长椭圆棒状。各种SDS蛋白复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷影响，而只与蛋白分子量有关。

下图左侧为几种常见蛋白质电泳迁移距离，右侧为未知蛋白质迁移距离，根据其相对其他蛋白质分子的迁移距离可算出该未知蛋白质的相对分子量。

2.2质谱（EMS-MS）

质谱法分析蛋白的基本原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白。通常结合相应的处理及其他技术，能够比较准确、快速地鉴定蛋白质。

电喷雾电离质谱（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。

2.3动态弹性光散射

动态光散射，也称光子相关光谱，准弹性光散射，测量光强

的波动随时间的变化。动态弹性光散射仪器，可以用来测量大分

子的分子量，故能用于蛋白质分子的定性分析。动态光散射法用

于测量粒度及分子大小。DLS可测量作布朗运动颗粒的扩散情况，

并采用斯托克斯-爱因斯坦方程转化为粒度与粒度分布，通过检测

不同浓度下的粒径可以计算Kd，DLS相互作用因子。

2.4沉降平衡超速离心