首批低分子肝素国家标准品的建立_李湛君
首批肝素抗Ⅱa因子效价测定用国家标准品协作标定
A collaborative study to establish the national standard for heparin with an assigned value obtained from anti-FIIa chromogenic method
LI Jing, WANG Yue, FAN Hui-HongA
(National Institutes for Food and Drug C ]
Objective To establish a national standard for heparin with an assigned value obtained from anti-FIIa chromogenic method.
中 国 生 化 药 物 杂 志 2016年 第 10期 总 第 3 6 卷
专题论文
DO I ： 10. 3969/j . issn. 1005-1678. 2016. 10. 003
首批肝素抗 n a 因子效价测定用国家标准品协作标定
李 京 ，王 悦 ，范慧红八
(中国食品药品检定研究院， 北 京 100050)
[ 摘 要 ] 目 的 建 立肝素抗 n a 因子效价测定用国家标准品。方 法 通过理化分析及效价测定， 筛 选 出适合的标准品原料， 溶 解、 分装、 冻干后制备成肝素国家标准物质待标品（ 140817-201501) 。 以 第 6 次 肝 素 国 际 标 准 品 07/328为 标 准 品 ， 分别采用《 中国药 典》 2 0 1 5年 版 和 2 0 1 0 年版肝素钠效价测定方法测定待标品的抗 H a 因子效价、 抗 X a 因子效价和抗凝效价， 由 1 3 个实验室协作标定。 为考察肝素国家标准品的延续性， 上一批肝素钠国家标准品（ 150509-200912)在 协作标定中使用 。结果 效 价 标 化 结 果 经 统 计 学 分 析， 实验室内及实验室间的几何变异系数 （ geometric coefficient of variation， gcv )均 小 于 10% ;以第6 次肝素国际标准品07/328作为标 准品， 待 标 品 抗 n a 因子效价为2011 IU/ 安瓿， 抗 X a 因子效价为1998 IU/ 安瓿， 抗 凝 效 价 为 1992 IU/ 安 瓿 ； 对 各 实 验 室 抗 n a 因子效 价、 抗 X a 因子效价、 抗凝效价几何均值进行单因素方差分析， 结果没有显著性差异； 各实验室使用国际标准品测定待标品抗 H a 因子 效价和使用上一批肝素钠国家标准品（ 150509-200912)测定的待标品抗凝效价几何均值进行 welch 检 验 ， 结果没有显著性差异， 肝素 国家标准品的延续性良好。结 论 经国家药品标准物质委员会审定后批准， 待标品（ 140817-201501)用作肝素效价测定用国家标准 品， 效 价 为 2011 IU/ 安瓿。 [ 关 键 词 ] 肝素； 国家标准品； 效价测定； 协作标定； 生色底物法； 抗 I l a 因子效价;抗 X a 因子效价； 抗凝效价 [ 中 图 分 类 号 ] R927 [文献标识码 ] A
低分子肝素分子量的测定
低分子肝素分子量的测定
姜维林;姬胜利
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】1998(019)003
【摘要】用高效液色相谱法，以低分子肝素的标准对照品为标准，测定了低分子肝素的平均分子量。
其重均分子量范围在３５００～５０００，分子量在８０００以下者占８５％以上，对该法的实验条件进行了探讨。
【总页数】3页(P116-118)
【作者】姜维林;姬胜利
【作者单位】山东医科大学药学院;山东医科大学药学院
【正文语种】中文
【中图分类】R973.2
【相关文献】
1.低分子肝素分子量测定方法介绍 [J], 王凤山;张天民
2.高效GPC测定聚甲基丙烯酸羟丙酯分子量和分子量分布测定的研究 [J], 陈昭国
3.海藻多糖分子量及其分布测定Ⅰ——“872”样品分子量的测定和K·α常数的标定 [J], 范慧红;管华诗;周如真
4.海藻多糖分子量及其分布测定Ⅱ——GPC/LALLS联机测定四种海藻多糖分子量分布 [J], 范慧红;管华诗;周如真
5.低分子肝素分子量及其分布测定实验 [J], 周如真
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生化药物质量标准中的生物检定及其进展
活性测定------定性
定性（鉴别 Identity）对质量控制能用理化测 定的产品，生物测定从主导地位的定量测定降 为次要的鉴别项的定性测定，只用较少的动物
例如USP29版：缩宫素（oxytocin）子宫收缩 法用于鉴别；升压素（Vasopressin）大鼠血 压升高法用于鉴别，效价测定均采用HPLC法 ChP2005版二部缩宫素仍用定量生物测定法
BP2007
孕马血清促性腺 雌幼大鼠卵巢增重法 激素
升压素
人胰高血糖素
大鼠血压升高法
兔血糖升高法
鉴别
工艺验证 效价测定
USP29
BP2007 ChP 2005
人红细胞生成素 小鼠网织红细胞计数
生化药标准中的体外生物检定（1）
离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法
生化药名 缩宫素 肝素
一般原则： 注射液为肌内注射：异常毒性、过敏反应物质等 检查项。原料和工艺易污染热原且用量较大者应 考虑设热原检查项 注射液为静脉注射 必需设异常毒性、热原(细菌 内毒素) 、过敏反应物质检查、降压反应物质检查、 溶血与凝聚检查等所有安全性检查项 多组分生化药注射剂基本技术要求 : 由于原材料为生物来源，成品中含有各种生化物 质，为保证注射给药的安全，一般须进行过敏物 质、降压物质、异常毒性等检查
发展趋势
减少实验动物用量、降低实验费用 缩短实验周期，提高实验准确度、精密度和稳 定性 检测方法的in vitro代替in vivo 简单代替繁琐
生物测定正从主导地位的定量测定降为辅助作 用的半定量、定性测定，直至被取代
胰岛素（动物胰腺提取）生物检定
一种低分子量肝素的制备方法[发明专利]
![一种低分子量肝素的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/71f61899f242336c1fb95ecd.png)
专利名称：一种低分子量肝素的制备方法专利类型：发明专利
发明人：陈士国,支梓鉴,叶兴乾
申请号：CN201710121658.1
申请日：20170302
公开号：CN106947004A
公开日：
20170714
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种低分子量肝素的制备方法，该方法通过超声、抗坏血酸和Fenton氧化反应联用，达到快速降解肝素的目的。
超声能够强化Fenton反应中Fe的还原，还原生成的Fe可进一步与过氧化氢发生反应，产生羟基自由基；同时抗坏血酸亦可强化降解体系，促进肝素的降解。
本发明所得的产品的重均分子量在4000‑5500Da，抗Xa因子活性为85‑105U/mg。
申请人：浙江大学
地址：310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
国籍：CN
代理机构：杭州求是专利事务所有限公司
代理人：邱启旺
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低分子肝素的结构确证研究_张震
表 1 BP2013 收载的 5 种低相对分子质量肝素的结构比较
项目
达肝素钠
那屈肝素钙
依诺肝素
帕肝素钠
汀肝素钠
降解路径
亚硝酸降解
亚硝酸降解
苄酯裂解
过氧化物降解
肝素酶降解
还原末端
6-O-硫 酸-2，5-脱 水-D- 6-O-硫 酸-2，5-脱 水-D- 15% ～ 25% 的 组 分 含 2-N，6-O-二 硫 酸-D-氨 2-N，6-O-二 硫 酸-D-
［Abstract］ The structural characterization of Low Molecular Weight Heparin is key point of these kinds of drug substances，and there have been many problems in the application files． In the article，the structural characteristic of heparin and low molecular weight heparin had been summarized，and the general thinking and study methods of these kinds of drug substances had been discussed from the view of point of drug evaluator．
欧洲药典第 5 版收载了 5 种低分子肝素［2］，分 别为：依诺肝素 （ enoxaparin） ，达肝素 （ dalteparin） ， 那屈肝素（ nadroparin） ，帕肝素（ parnaparin） 和汀肝 素（ tinzaparin） 。这些低分子肝素由不同厂家研发，
低浓度等渗肝素钠注射液国内外研发进展
一
种能直接使用 的肝素钠封管液 。 山东莱 阳生化制药厂 于 ２０ ０ ６年 开始研发低 浓度等渗 肝
２ 国 内研发情况
素钠注射液 （ 枫管 叶 Ｒ） 规格 为 ５ｍ ： ０ ， ｌ５ ０单位 ， 主要应 用 拟 于临床静脉 留置 针 的封 管 ， 可用 于儿童 患者 的全 身用药 ， 也 应为全球首家 申报此规 格 的低浓度 等渗 肝素 钠注射 液 的生
度 和关 键的质量标准 问题等进行 了详 细的介绍 。
１ 研发背景
国内在生产或在研发 的肝素 类 品种 包括肝 素钠 、 低分 子
肝 素钠 、 达肝 素钠 、 诺 肝素 钠 、 伊 贝米 肝素 钠 、 分子 肝素 钙 低 等 多个 品种。当用于静脉 留置针 的封 管时 ， 是希望 药 品发 挥 局部抗 凝血作用 ， 防止 针头堵 塞 形成 血栓 ， 而不 希望 其发 挥 全身作 用 。因此 ， 管近年来低分子 肝素钠 等新 的肝素类 的 尽 药物广 泛应用于 临床 ， 普通 的肝 素钠 由于具备 半 衰期 最短 、
液效 果 最 佳 ， 用 最 为 普 遍 “Ｊ 使 。具 体 配 制 方 法 为 采 用 ２ｍ ：２ ０ 单位 将 规 格 的肝 素 钠 注射 液 稀 释 于 ２ ０ ｍ ｌ１５ ０ ５ ｌ的 ０９ ． ％氯化钠 注射 液 中配制而成 ， 次封管 使用 ２～ 。但 每 ５ｍｌ 这种封管方 法存 在配制繁琐 、 容易污 染 、 质量不 稳定 、 浪费 等
介 绍。
【 关键词 】 静脉 留置针 ； 封管 ； 低浓度等渗肝素钠注射液 ； 枫管叶 ； Ｈｐｒ ｃ ｆｓ ｓｕｏ ｅａｎｌ ｋｌ ｈ ｏ ｔｎ ｉ ｏ ｕ ｌｉ
ｄｉ１ ．９ ９ ｊｉ ｎ １７ ｏ：０３ ６ ／．ｓ ． ６ ４—４ ８ ．０ ２ ０ ．０ ｓ ９ ５２ １． ２ １４
低分子肝素药物的质量标准综述
低分子肝素药物的质量标准综述摘要本文通过对国内外低分子肝素质量标准、生产工艺、结构特点、药理作用等比较和总结，为我国低分子肝素产业的进一步发展提供参考。
关键词低分子肝素;质量标准；生产工艺；结构;药理中图分类号R9 文献标识码A 文章编号1674-6708(2010）25—0091—02肝素是临床常用的抗凝血药，但在临床使用中暴露出很多缺点，如:剂量个体差异大,自发性出血倾向,停药后血栓易复发等，还有可引起血小板减少症，长期应用可产生暂时性脱发、骨质疏松和自发性骨折等不良反应[1]。
随着对肝素的深入研究，特别是对以往认为无活性的低分子组分对Xa因子和凝血酶（thrombin)的作用差异的认识，为开发LMWH的提供了理论依据，20世纪70年代末,LMWH 进入临床.低分子量肝素（low-molecular-weight heparin,LMWH)是未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)中具有较低分子量的组分或片段，具有与UFH相同的母体结构。
UFH是一种高度硫酸化的糖胺聚糖,分子量范围为3 000～30 000.LMWH是近20年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物,是采用适当方法将肝素分级或降解得到的具有较低分子量的肝素组分或片段3 000~8 000。
在临床使用中，与肝素比较,LMWH抗血栓作用强,抗凝血作用弱于肝素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小，按体重给药,抗凝效果可以预测等优点[2］,目前已逐步取代肝素应用于临床。
国外已有超低分子肝素研究[3］，其平均分子量为2 000~3 000,抗FXa/FIIa>30，已经进入III期临床研究.1 国内外几种LMWH的质量标准综述目前，国外LMWH商品约有十多种,我国进口的有6种,国内仿制的四类新药生产企业约有十几家。
我国有低分子肝素钠部颁标准。
总的来说，LMWH的重要指标要求重均分子量小于8 000，分子量小于8 000 的组分含量不得低于60%,按干燥品计算，抗Xa效价≥70IU/mg，抗Xa/抗IIa≥1。
低分子肝素胶囊稳定性的初步研究
低分子肝素胶囊稳定性的初步研究
崔慧斐;李华;李婧
【期刊名称】《中国医药工业杂志》
【年(卷),期】1998(29)11
【摘要】考察了低分子肝素（１）胶囊在不同条件下的稳定性，其中抗凝活性采用羊血浆法测定，平均回收率为９８．８％（ＲＳＤ＝１．４％）；溶出度以天青Ａ法测定，平均回收率为１０２．６％（ＲＳＤ＝０．９％）。
结果表明，１胶囊在各考察条件下其外观性状、抗凝效价、红外图谱基本无变化，有效期可暂定１～２年。
【总页数】3页(P495-497)
【关键词】低分子肝素;胶囊;稳定性;溶出度;肝素
【作者】崔慧斐;李华;李婧
【作者单位】山东医科大学生化制药教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R973.2;R927.11
【相关文献】
1.愈伤灵胶囊初步稳定性研究 [J], 张倩瑶;解春文;于秀丽
2.补肾扶正胶囊初步稳定性研究 [J], 陈登丰;何孝金
3.中药软胶囊稳定性的初步研究 [J], 邝薛洪;谭伯森;陈敏坚
4.低分子肝素钠自微乳缓释胶囊的制备及其药效学的初步研究 [J], 胡晶晶;张钧寿;
周建平
5.欣泰胶囊初步稳定性研究 [J], 唐俊峰
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国家药监局药审中心关于发布《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》的通告
国家药监局药审中心关于发布《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》的通告
文章属性
•【制定机关】国家药品监督管理局
•【公布日期】2021.08.06
•【文号】
•【施行日期】2021.08.06
•【效力等级】部门规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】药政管理
正文
国家药监局药审中心关于发布《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》的通告
为规范低分子量肝素类产品的研究和开发，促进化学仿制药品注射剂的研究和评价工作，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《低分子量肝素类仿制药免疫原性研究指导原则（试行）》（见附件）。
根据《国家药监局综合司关于印发药品技术指导原则发布程序的通知》（药监综药管〔2020〕9号）要求，经国家药品监督管理局审查同意，现予发布，自发布之日起施行。
特此通告。
国家药监局药审中心
2021年8月6日。
低分子肝素质量标准研究_李京
肝素是临床广泛应用的一类抗凝血药物，属于高度硫酸 化的糖胺聚糖。2008 年以来，国内外对肝素类产品的质量及 质量标准问题十分 关 注［1-2］ ，欧 洲 和 美 国 药 典 几 次 修 订 了 肝 素钠的药典标准，《中国药典》2010 年版也对肝素标准进行 了大幅提高［3］。2009 年和 2010 年连续 2 年的全国药品评价 性抽验结果表明，目前我国市场上的肝素钠注射液质量是可 靠的［4］。低 分 子 肝 素［5］ （ low-molecular-weight heparin，LMWH） 是由肝素分级或降解得到具有较低相对分子质量的组 分或片段，其抗血栓作用优于肝素，生物利用度高、出血倾向 小，是肝素的第二代产品。2011 年 LMWH 注射剂评价性抽 验暴露出我国 LMWH 产品质量及质量标准都存在一些问 题，多批产品相对分子质量与活性不合格，质量标准与国外 原研厂家的差距较大［6］。抗凝药市场销售额逐年上升，国内 有多家企业同时进行新药申报，市场竞争激烈，对产品质量 要求高。LMWH 已于 2012 年进入我国基本药物目录，是《中 国药典》2015 年版备选品种，质量标准提高工作迫在眉睫。
ABSTＲACT： OBJECTIVE To revise the national specification low molecular weight heparin for improving the quality and quality control level its domestic products as candidate new varieties Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. METHODS Domestic and imported original products and related information were collected，including 27 batches raw material from 11 manufacturers and 49 batches injections from 13 manufacturers. Domestic low molecular weight heparin products were classified according to the production process. The analysis focused on the verification structure，molecular weight and activity，process impurities，and degradation impurities. Various physical，chemical and biological methods were used，such as ion chromatography，size exclusion chromatography，reversed phase chromatography，gas chromatography，NMＲ，atomic absorption spectrometry，micro-chromogenic substrate methods，and so on. ＲESULTS The domestic low molecular heparin products were divided into three categories： dalteparin sodium，enoxaparin sodium，and nadroparin calcium. Eight draft specifications the raw material and preparations have been made. In the draft specifications，eight items have been added： structure type，production，1，6-anhydro derivatives for enoxaparin sodium，free sulfate，nitrite，benzyl alcohol，ultraviolet absorption maximum specific absorption enoxaparin sodium，and residual solvent； 15 items have been revised： Chinese name，English name，definition，characters，pH value，molecular weight and molecular weight distribution，anti-FⅩa activity，the ratio between anti-FⅩa and anti-FⅡa activity，the color the solution，sodium，sulfate and carboxylate ratio，loss on drying，volume injection，storage， preparation； one item has been deleted： light absorption at 260 and 280 nm. CONCLUSION The current draft specifications low molecular weight heparin have been greatly improved than the national specifications established in 2005. The products are divided into three categories. A lot items have been added and the limits are more reasonable. The draft specifications are roughly equal with the Europe
抗凝药物发展简史
Double-blind
* 5 mg if body weight <50 kg 10 mg if body weight >100 kg
5 days SC enoxaparin (1 mg/kg bid) + OAC (INR 2-3)
90 ± 7 days
Primary Efficacy Outcome (3 months) • Fatal PE/unexplained death • Recurrent symptomatic nonfatal PE or DVT
* Hirsh J, et al. Low Molecular Weight Heparins. Fourth Edition
UFH-LMWH-戊糖
混和物 or 化合物 作用靶点
蛋白结合
激活血小板
UFH 混和物
Xa, IIa 高 强
LMWH
安卓
混和物
化合物
Xa为主，IIa 低 弱
只作用于Xa 无 无
安卓比依诺肝素更可靠的预防骨科大手 术后的深静脉血栓的形成：荟萃分析
Ephesus试验 N = 1817
磺达肝癸钠更好
58.5%
依诺肝素更好
Pentathlon 2000试验 N = 1584
Penthifra试验 N = 1250
Pentamaks试验 N = 724
28.1% 61.6% 63.1%
15 (1.4%) 41 (3.6%) 56 (5.0%)
-3.0%
-1.2%
0 0.5%
Fondaparinux - UFH (95% CI)
MATISSE DVT2
Fondaparinux (n=1,098)
低分子肝素药用现状及质量标准概况
低分子肝素药用现状及质量标准概况
李京;范慧红;徐康森
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2004(025)001
【摘要】通过对国内外低分子肝素研究现状的总结及对各生产厂家质量标准、药典标准的比较,初步确定了低分子肝素国家标准中应包括的项目、限度和检测方法,为该品种上<中国药典>2005年版作准备.
【总页数】3页(P53-55)
【作者】李京;范慧红;徐康森
【作者单位】中国药品生物制品检定所,北京,100050;中国药品生物制品检定所,北京,100050;中国药品生物制品检定所,北京,100050
【正文语种】中文
【中图分类】R972
【相关文献】
1.药用辅料质量标准的现状及控制要点 [J], 徐魁;韩勇
2.低分子肝素药物的质量标准综述 [J], 张利赟
3.蒲公英质量标准提升及不同产地药用蒲公英质量评价 [J], 惠西珂;李超;谷巍;巢建国;王凯;韩怡;王玉卓;王圆圆;张松保
4.制药用压缩空气制备系统及质量标准分析 [J], 赵树勇
5.药用辅料黑氧化铁质量标准探讨与改进 [J], 刘菁;吴燕
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国内低分子肝素制剂研究进展
国内低分子肝素制剂研究进展
谢继青;潘菡清;袁成
【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2003(24)5
【摘要】目的概述近几年来国内报道的低分子肝素(LMWH)制剂的研究进展.方法通过查阅1980～2002年中国生物期刊文摘库(CBA),对有关LMWH的制剂进行分析.结果与结论LMWH的制剂目前有注射剂、胶囊剂、舌下含片、软膏剂、凝胶剂、喷雾剂及栓剂等.
【总页数】3页(P260-262)
【作者】谢继青;潘菡清;袁成
【作者单位】济南军区总医院,药学部,山东,济南,250031;济南军区总医院,药学部,山东,济南,250031;济南军区总医院,药学部,山东,济南,250031
【正文语种】中文
【中图分类】R943;R977.6
【相关文献】
1.低分子肝素制剂的研究进展 [J], 赵军;王娟;翟光喜
2.低分子肝素制剂的研究进展 [J], 赵军;王娟;翟光喜
3.抗凝制剂——低分子肝素的研究进展 [J], 赵秀丽;胡大一
4.低分子肝素口服制剂的研究进展 [J], 张兆蓉
5.低分子肝素非注射制剂的研究进展 [J], 李攀;秦永文
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国产低分子肝素钙在血液透析中抗凝作用的临床观察
国产低分子肝素钙在血液透析中抗凝作用的临床观察
刘碧波;区冰玲
【期刊名称】《中南药学》
【年(卷),期】2004(2)4
【摘要】低分子肝素钙(CX)由于具有抗凝作用强、出血危险性小、生物利用度高、使用方便等优点,我院应用于血液透析(HD)中的抗凝血作用,本文从抗凝作用的疗效、安全性等方面观察国产CX的临床疗效.
【总页数】2页(P245-246)
【关键词】国产低分子肝素钙;血液透析;抗凝作用;临床观察
【作者】刘碧波;区冰玲
【作者单位】广东省东莞市人民医院
【正文语种】中文
【中图分类】R973.2
【相关文献】
1.国产低分子肝素钠在血液透析抗凝中的疗效观察 [J], 陶艳菊;陈莲;张婷;李铭新;
李海明
2.低分子肝素钙给药不同时间对血液透析抗凝效果的观察 [J], 鹿香花;马秀芳;赵辉
3.国产与进口低分子肝素在血液透析中抗凝作用的比较 [J], 刘志强;王力;刘俊
4.普通肝素与低分子肝素钙在血液透析抗凝中的疗效观察 [J], 刘志蓉;张小梅;傅龙梅
5.国产低分子肝素钙用于血液透析的抗凝作用 [J], 卞维静;谭昭;赵丽
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·交流·首批低分子肝素国家标准品的建立中国药品生物制品检定所 北京 100050李湛君 刘建文 徐康森江苏省药品检验所 南京 210008蔡美明广西壮族自治区药品检验所 南宁 530021罗远秀 低分子肝素(LMWH )比普通肝素抗血栓作用强,出血副作用小,有较高生物利用度和较长的生物半衰期[1],其抗血栓作用与其抗活化Ⅹ因子(抗F Ⅹa )活性相关,抗凝作用与其抗活化Ⅱ因子(抗F Ⅱa 即抗凝血酶)活性相关[2,3],英国药典BP1998已收载该品种,我国已有多家单位研究生产并申报新药,LMWH 质量标准拟上中国药典2000年版增补版,而质量标准实施中必须要有标准品。
WHO 已于1987年制备并发行LMWH 第一次国际标准品,批号85/600[4],以及1993年发行用于测定分子量分布的LM WH 第一次国际参考品(IRR ),批号90/686,故制备我国LMWH 国家标准品已迫在眉捷。
由中国药品生物制品检定所生化药品与基因工程药物室制备并组织协作标定了LM WH 首批国家标准品。
1 材料与仪器LMWH 原料:德国KNOLL 公司生产LM WH ,钠盐形式的冻干粉,经测试平均分子量及其分布以及各项指标均符合BP1998版标准及企业标准,即平均分子量小于8000(企业标准3150～5150),分子量分布小于8000的至少占60%(企业标准2000～6000的占52.5%～87.5%),抗F Ⅹa 效价大于70I U ·mg -1,抗F Ⅹa :抗F Ⅱa 比率大于1.5(企业标准3.6～6.1)。
待标LMWH 国家标准品(T )的制备:LM WH 原料约5.5g (其处方中只有LMWH ,因其为多糖,稳定性强,水溶液可直接冻干,无需加辅形剂)溶于双蒸水,用精密分装器分装于清洁的安瓶中,每支0.2mL (含LM EWH 约5mg ),经冻干后熔封,检漏。
冻干待标标准品水分测定值为2.6%±0.1%(2.5%,2.7%,2.7%),-20℃,避光保存。
临用时配制成与S (标准品)相当浓度的溶液T1～T4[5]。
LM WH 标准品(S )第一次国际标准品:批号85/600,抗F Ⅹa 每支1680IU 、抗F Ⅱa 每支665IU ;取1支加双蒸水溶解成每1m L 含抗F Ⅹa 168IU 、抗F Ⅱa 66.5IU 的贮备液,临用时稀释成适当浓度,S1～S4[5]。
抗凝血酶(AT Ⅲ),活化Ⅹ因子(F Ⅹa ),发色底物S -2765和S -2238均为Sw eden Chro -mogenix 产品,凝血酶,每支430IU (中国药品生物制品检定所国家标准品),临用时配成相应浓度的溶液[5]。
tris -EDTA 缓冲液(R1),pH 8.4[6]和tris -氯化钠牛血清白蛋白缓冲液(R2),pH 7.4[6]。
日立U -3210型可见紫外分光光度计2 方法与结果实验方法按BP1998LMWH 中抗F Ⅹa 和抗F Ⅱa 的测定法,即取18支小管,第1支与第18支为空白管,其它各管按S1※S4,T1※T4,T1※T4,S1※S4顺序排列,依次加入相应S 和T 各浓度溶液每管50μL ,空白管每管加缓冲液R250μL ,其余各管每管加浓度为1IU ·mL -1或0.5IU ·mL -1(测抗F Ⅱa 用)的AT Ⅲ50μL ,混匀后37℃水浴平衡1min ,每管加F Ⅹa 或凝血酶(测抗F Ⅱa 用)100μL ,混匀后37℃水浴平衡1min ,每管加S -2765或S -2238(测抗F Ⅱa 用)250μL ,混均37℃水浴平衡4min 立即每管加入30%冰醋酸375μL 终止反应。
405nm 处以缓冲液R2为空白液测定各管吸收度A ,以A 作为反应值,按量反应平行线原理,4×4法统计计算[7],实验可靠性测验必须通过。
抗F Ⅹa 活性测定,检定所进行了9次独立实验,合并计算效价(potency ,PT )为每支818IU ,平均可信限率(FL %)为9.7%,江苏与广西药检所完成8次独立实验,PT 为891.7,FL %为6.5%,再经加权平均合并计算PT 为每支845IU ,FL %为6.50%,见图1及表1。
图1 LM WH 首次国家标准品抗F Ⅹa 效价标定结果分布Fig 1 Frequency distribution of potency estimatesby anti -F Ⅹa collaborative assays for LM WH 1st National Standard·296· 药物分析杂志 DOI :10.16155/j .0254-1793.2001.04.027表1 LMWH 首次国家标准品抗F Ⅹa 效价标定结果Tab 1 The results of potency estim ates by anti -F Ⅹa collaborative assays for LMWH 1st National Standard标定单位(participants )序号(No .)PT (IU per am p )校正权重(adj usted weigh t )加权平均PT(average PT )平均F L %(average FL %)几何均数(geometric mean )gcv /%中检所(National Insti -tute for the Con trol of Pharmaceutical and Bio -l ogical Products )1886.691.32975.6383.83970.7408.14956.1420.35760.2402.7818.49.7823.62.36650.5399.1(742.7～901.9)7656.5412.08811.1414.69825.0428.0江苏与广西药检所(Jiangsu &GuangxiInstitute for Drug Con -trol )1866.0279.521031.2403.23685.1257.74977.890.95845.8411.1891.76.5883.61.86886.1384.4(835.6～951.6)7902.8187.38918.5397.6合并计算(combine cal -cul ation )845.16.0851.32.1 抗F Ⅱa (抗凝血酶)活性测定。
检定所完成8次独立实验,P T 为每支187.9I U ,FL %为3.4%,江苏与广西药检所完成8次独立实验,P T 为每支183.4I U ,FL %为5.6%,经加权平均合并计算PT 为每支186.0IU ,FL %为2.8%,见表2及图2。
标准品稳定性:本批LMWH 标准品室温放置12个月,其抗F Ⅹa 和抗F Ⅱa 活性与放置前相比,其差异无显著性意义;LMWH 国际标准品曾在45℃和65℃放置12个月,其差异也无显著性意义,由表2 LMWH 首次国家标准品抗F Ⅱa 效价标定结果Tab 2 The results of potency estimates by anti -F Ⅱa collaborative assays for LMWH 1st National standard标定单位(participants )序号(No .)P T(IU per am p )校正权重(adj usted weigh t )加权平均PT(average PT )平均F L %(average FL %)几何均数(geometric mean )gcv /%中检所(National Insti -tute for the Con trol of Pharmaceutical and Bio -l ogical Products )1191.611080.32174.51679.73181.92890.54164.8485.2187.95168.9564.2(181.7～194.3)3.4180.51.56170.8384.87210.71449.08185.2326.3江苏与广西药检所(Jiangsu &GuangxiInstitute for Drug Con -trol )1183.8784.62189.6460.53188.9771.64227.8674.7183.65179.41126.1(173.5～194.2)5.6186.32.36207.7600.77171.11780.38151.6558.9合并计算(combine cal -186.72.8183.41.9·297· 21(4),2001图2 LM WH首次国家标准品抗FⅡa效价标定结果分布Fig2 Frequency distribution of potency estimates byanti-FⅡa col laborative assays for LM WH1st National S tandard此预测该标准品贮存于-20℃每年最大降解值为0.001%[4]。
故认为本批标准品-20℃保存稳定。
3 讨论BP1998对抗FⅡa实验用凝血酶要求用人凝血酶,而BP1993增补版未作要求,在LMWH第一次国际标准品协作标定中6个单位用人凝血酶,5个单位用牛凝血酶,其结果没有差异[4],故本协作标定均用牛凝血酶。
因LMWH国际标准品只有1支,故所有实验者(江苏所与广西所实验者相互监督实验,故其结果合并)均在检定所实验室内进行实验,但每一结果均为独立实验,即取新的待标国家标准品及国际标准品储备液。
用于合并计算的标定结果均选用实验可靠性测验通过的实验结果,抗FⅩa协作标定,几何变异系数(geometric coefficient of variation, g cv)为2.1%,抗FⅡa的gcv为1.9%;国际标准品协作标定中应用本方法即酰胺分解ATⅢ法的g cv为5.9%～24.2%,抗FⅡa凝血酶抑制酰胺分解法的gcv为8.2%～18.5%[4],故本标准品标定结果可靠、准确、变异小。
BP1998LMWH测定抗FⅩa和抗FⅡa活性测定方法均为理化测定方法,即分光光度法,采用纯化的ATⅢ和发色底物,使整个反应属生化范畴,而不用血浆等可能误差大的生物产品,符合国际上尽可能用理化分析方法代替生物测定的原则,故本标定中采用BP1998这一法定方法。
经研究本批LM WH首次国家标准品批号为064720001,抗FⅩa效价为每支845IU,抗FⅡa (抗凝血酶)效价为每支186IU。