分配层析ppt课件
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《层析技术》课件
关键突破
20世纪50年代的气相层析和液相层析的发展为该技术的应用奠定了基础。
扩大应用
20世纪60年代起，层析技术逐渐被应用到生物化学、医药学等领域。
层析技术原理
层析柱的构成
层析柱由固定相填充而成，固定相具有不同的选择 性，用以分离目标物质。
分离原理
分离原理包括吸附、离子交换、分配和亲和等不同 机制。
食品科学
食品质量检测和添加 剂分析中，层析技术 广泛应用。
环境检测
层析技术可用于水质 监测、环境污染物分 析等领域。
层析技术的优缺点
1 优点
层析技术操作简单，分离效果好，适用于不同样品类型。
2 缺点
层析技术对分离介质的选择敏感，操作条件需谨慎控制。
层析技术的发展趋势
1
检测方法的提高
2
新的检测方法提高了层析技术的灵敏度
和选择性。
3
制备方法的改进
新的制备方法使层析柱更高效、更可靠。
应用领域的扩展
层析技术在新兴领域如环境保护和药物 控制中得到了更广泛的应用。
结论
层析技术的重要性
层析技术在科研和工业领域中的应用不可替代。
层析技术的未来发展展望
随着技术的进一步发展，层析技术将在更多领 域发挥重要作用。
层析技术的分类
按照分离方式的分类
层析技术可分为液相层析、气相层析、超高效液相 层析等不同类型。
按照分离介质的分类
层析技术可使用不同的分离介质，如硅胶、反相材 料和离子交换树脂等。
层析技术应用
生物化学
层析技术在生物化学 中用于酶分离、蛋白 质纯化等关键步骤。
医药学
层析技术在药物分析 和药物研发中发挥着 重要作用。
《层析技术》PPT课件
20世纪50年代的气相层析和液相层析的发展为该技术的应用奠定了基础。
扩大应用
20世纪60年代起，层析技术逐渐被应用到生物化学、医药学等领域。
层析技术原理
层析柱的构成
层析柱由固定相填充而成，固定相具有不同的选择 性，用以分离目标物质。
分离原理
分离原理包括吸附、离子交换、分配和亲和等不同 机制。
食品科学
食品质量检测和添加 剂分析中，层析技术 广泛应用。
环境检测
层析技术可用于水质 监测、环境污染物分 析等领域。
层析技术的优缺点
1 优点
层析技术操作简单，分离效果好，适用于不同样品类型。
2 缺点
层析技术对分离介质的选择敏感，操作条件需谨慎控制。
层析技术的发展趋势
1
检测方法的提高
2
新的检测方法提高了层析技术的灵敏度
和选择性。
3
制备方法的改进
新的制备方法使层析柱更高效、更可靠。
应用领域的扩展
层析技术在新兴领域如环境保护和药物 控制中得到了更广泛的应用。
结论
层析技术的重要性
层析技术在科研和工业领域中的应用不可替代。
层析技术的未来发展展望
随着技术的进一步发展，层析技术将在更多领 域发挥重要作用。
层析技术的分类
按照分离方式的分类
层析技术可分为液相层析、气相层析、超高效液相 层析等不同类型。
按照分离介质的分类
层析技术可使用不同的分离介质，如硅胶、反相材 料和离子交换树脂等。
层析技术应用
生物化学
层析技术在生物化学 中用于酶分离、蛋白 质纯化等关键步骤。
医药学
层析技术在药物分析 和药物研发中发挥着 重要作用。
《层析技术》PPT课件
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
层析法-理论ppt课件
方法：
(1) oligo(dT)-纤维素层 析柱法
(2) oligo(dT)-纤维素液 相结合离心法
(3)磁珠分离法
oligo(dT)-纤维素层析柱法
磁 珠 分 离 法
配体与载体结合
(固相化)
亲和层析
装柱
的基本过程
(亲和层析柱)
解吸附 洗柱
亲和吸附
(生物高分子与配体专一结合)
配体与载体的联接方法
固定相——滤纸上的吸附水 流动相——溶剂(乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶
的溶剂)
分离示意图
层 析 纸
层析缸
溶剂前沿
y x2
x1 起始线
(原点)
展开剂
Rf > 0.02 ，A 、B可分离. 与标样比较可定性鉴定
. 如果两种氨基酸的迁移速率相近，
或者氨基酸的Rf值相同，如何来分
离？
氨基酸的Rf值
展开剂 正丁醇+吡啶+水
名称
分离原理
固定相只能与一种待分离
亲和层析法 组份专一结合，以此和无 亲和力的其它组份分离
层析法的分类
• 按操作形式不同分类
名称
操作形式
柱层析法 固定相装于柱内，使样品沿着 一个方向前移而达分离
纸层析法 用滤纸作液体的载体，点样后 用流动相展开，使各组份分离
将适当的高分子有机吸附剂制成 薄膜层析法 薄膜，以类似纸层析方法进行物
加入样品 层析后
实验：胡萝卜的 柱层析分离法
柱层析示意图
薄层吸附层析
( Thin layer absorption chromatography)
薄层吸附层析是将吸附剂 均匀地在玻璃板上铺成薄层， 再把样品点在薄层板上，点样 的位置靠近板的一端。然后将 板的这端浸入适当的溶剂(流 动相)中，使溶剂在薄层板上 扩散，并在此过程中通过吸附 →解吸→再吸附→再解吸的反 复进行，而将样品各个组分分 离出来。
《生物学层析法》课件
实际应用案例
食物颜料分离
层析法可用于鉴定和分离食物中 的色素。
药物分析
层析法可以分离和测定药物中的 不同成分。
环境分析
层析法可用于环境样品中污染物 的分离和检测。
优势和局限性
1 优势
简单易操作，分离效果好，广泛应用度较慢，分离效率受到样品性质和实验条件的限制。
常见错误和注意事项
《生物学层析法》PPT课 件
层析法是一种在生物学研究中常用的分离和分析技术。本课件将介绍层析法 的概念与原理，基本步骤，不同类型的层析法，实际应用案例，优势和局限 性，常见错误和注意事项，最后进行总结。
概念与原理
层析法是一种分离和分析技术，通过不同物质在固定相和流动相中的分配系数差异，实现混合物的分离。
基本步骤
1
样品加载
将待分离的混合物加载到层析柱或层析纸上。
2
流动相流动
通过柱床或层析纸，使流动相在不同组分间逐渐分离。
3
收集分离物
按照需要，逐段收集分离得到的组分。
不同类型的层析法
薄层层析法
将样品涂抹在薄层介质上进 行分离。
柱层析法
通过柱床进行样品的分离。
气相层析法
通过气相站和液相站将混合 物分离。
错误
1. 选择错误的固定相和流动相。 2. 加载样品过多或过少。 3. 不仔细观察分离结果。
注意事项
• 准备好合适的实验器材。 • 注意实验室安全。 • 根据需要进行进一步分析和确认。
总结与结束语
层析法是一种重要的生物学实验技术，通过分离混合物的不同成分，为生物学研究提供了有力工具。掌握层析 法的原理和操作技巧，将可以更好地实施生物学实验和开展科学研究。
凝胶电泳及分配层析PPT优秀课件
特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，
引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分
离效果。 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合
于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质
来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对
• 基本原理及过程
2021/6/3
6
• 琼脂糖凝胶电泳原理：
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L
－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂
糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变
为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在
• 分配系数
•
分配色谱的狭义分配系数表达式如下：
•
K=Cs╱Cm=（Xs/Vs）╱（Xm/Vm）
•
式中Cs代表组分分子在固定相液体中的溶解度，Cm代表组分分
2021/子6/3在流动相中的溶解度。
2
• 三 过程
• 在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、 硅藻土、纤维素等）吸附一种溶剂为固定相，这种溶剂在 层析过程中始终固定在多孔支持物上；另一种与固定相溶 剂互不相溶的溶剂可沿着固定相向流动，称为流动相。当 某溶质在流动相的带动下流经固定相时，该溶质在两相之 间进行连续的动态分配。
2021/6/3
4
• 纸层析设备简单，操作简便，所需样品少，分辨能力一
般能达到要求，在实验室用于各种组分的分离并进行定性 定量分析。但是其展开时间长，分离量小，不适用于大量 组分的工业划分离生产，而且作为流动相的有机溶剂可能 引起酶的变性失活。
氨基酸的分离鉴定纸层析法ppt课件
（4）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧
边缘不能接触且要保持平行，参见图3-3。向培养 皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右， 将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端 在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大 烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线 时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升 的高度，填入表3-1中。当上升到15～18cm， 取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿 线，迅速用电吹风热风吹干。
（2）规划：带上手套，取宽约 14cm、高约22cm的层析滤 纸一张。在纸的下端距边缘 2cm处轻轻用铅笔划一条平 行于底边的直线A，在直线 上做4个记号，记号之间间隔 2cm，这就是原点的位置。 另在距左边缘1cm处画一条 平行于左边缘的直线B，在B 线上以A、B两线的交点为原 点标明刻度（以厘米为单 位），参见左图。
（3）点样：用微量注射器分别取10mL左右的氨基酸样 品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以 免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同 一位置上需点2～3次，2～3mL/次，每点完一点，立 刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的 直径最大不超过3mm。每人须点4个样，其中3个是已 知样，1个是待测样品。
（8）将微量注射器内外用蒸馏水清洗干净，倒掉用 过的展层液和平衡液，将培养皿洗净，整理好桌面上 的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验 收，实验报告当场交给老师。
计算
Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距
离
记录与计算汇总
扩展剂前沿上升速度
X（min） 0 5 10 15 20 30 40 60 90 … 18
一、实验目的
掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待 测样品的氨基酸成分。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内 部，然后再扩散出来，经历的流程长， 流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用 烧杯收集流出液，（注意柱床上 要不断加水，保持1cm高水层） 直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）
凝胶电泳及分配层析
a
4
• 纸层析设备简单，操作简便，所需样品少，分辨能力一
般能达到要求，在实验室用于各种组分的分离并进行定性 定量分析。但是其展开时间长，分离量小，不适用于大量 组分的工业划分离生产，而且作为流动相的有机溶剂可能 引起酶的变性失活。
• 二 薄层层析 薄层层析是将作为固定相支持物均匀的
铺在支持板（一般用玻璃板）上，成为薄层。把样品点到
•
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果
需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择
聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应
该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能
跑不出胶孔导致缺带。
辨率高，重复性好。 3） 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测 及定量测定。 4） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可 长期保存。
a
8
• 操作流程
• 准备干净的配胶板和电泳槽
•
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号
弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法
薄层上，用适宜的溶剂展开，利用各种组分的移动距离不
同，而使各组分分离。如果支持物是固定吸附剂，如硅胶、
氧化铝、聚酰胺等，层析时是依据吸附力的不同使组分分
离，则称吸附薄层层析；如果支持物是纤维素、硅藻土等，
层析时主要依据分配系数的不同而使组分分离，则称分配
薄层层析。薄层层析的展开时间段，分辨率比纸层析高
间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较
好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控
制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的
层 析PPT演示课件
17
分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
18
从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
42
四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
43
特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
35
Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。
分配系数K值大,说明物质在层析中被 固定相吸附得比较牢固,随流动相迁移的速 度较慢,留在固定相中的时间较长,在洗脱液 中后出峰。若分配系数K值小，则该物质在 洗脱液中较早出峰。
18
从一个混合物中分离和纯化一种生物 物质的纯度如何，取决于混合物中各组分K 值的差异程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能 较易地把混合物中的生物物质分离。反 之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物 质分离。
42
四.凝胶的结构与性能
1.葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex） 结构： 葡聚糖用交联剂1-氯代-2 ,3-环丙烷使葡聚糖
之间通过醚键(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交联
OH
聚合而成的三维空间网状结构。
43
特点：
Sephadex 的三维空间网状结构的网孔大小取决于交 联度,交联度的大小可在合成Sephadex 时控制加入 交联剂的百分比决定.交联剂的百分比高,交联度大, 网状结构愈紧密,孔隙愈小,吸水后膨胀也愈小,机械 强度高,分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百 分比低,分离物质的分子量大。G类Sephadex的型号 表示每克干凝胶吸水量x10,如G-50表示每克干凝胶 吸水量为5ml。
（最好有颜色以便于观察如Hb、印度黑墨水） 通过实际测量求出.Vi可由g·Wr求得（g为干 凝胶重,单位为克,Wr为凝胶的吸水量以ml/g 表示）。
35
Ve - Vo Kd = ————
Vi （1）Kd = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排阻 于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。 （2）当Kd = 1时,Ve = Vo + Vi,意味着该分子完全 不被排阻,可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部,它 能均等地分布在流动相和固定相里,在两相分配的 比值为1,而最后流出. （3）当0 <Kd <1, Ve = Vo + ViKd为处于两种极 端行为之间的分子。
第3章 氨基酸分离分析ppt课件
填充物 固
尼龙网格、烧 结玻片或其他 支持物 尽可能小的 死体积 分部收集管 4
• 柱层析：层析柱中的填充物（支持剂）都是一些 具有亲水性的不溶物质：纤维素、淀粉、硅胶等。 它们吸附一层不流动的结合水，可以看作固定相， 流过的互不溶的溶剂是流动相。
• 纸层析：滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层 用的溶剂是流动相。混合氨基酸在这两相中不断 分配而被分布在滤纸的不同位置上。只要实验条 件确定，每种氨基酸的相对迁移率恒定。分离、 鉴定氨基酸的常用技术。
ppt精选版
1
物质不仅在互不相溶的两液相间分配，也可 以在固相-液相间或在气相-液相间分配。
层析系统中的固定相可以是固相、液相或固 -液相混合相（半液体）；流动相可以是液 相或气相，它充满于静相的空隙中，并能 流过静相。
ppt精选版
2
某一物质在动相中的总量 Keff =
某一物质在静相中的总量
Keff =
第四节 氨基酸混合物的分析分离 p148
一、分配层析的一般原理
层析即色层分析又称色谱(chromatograph)。所 有层析系统均有两相组成：
固定相(stationary phase)
流动相(mobile phase)
混合物在层析系统中的分离决定于各组分在两相中 的分配。
1891年Nerst提出分配定律：当一种溶质在两种互 不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后， 溶质在两相中的浓度比为一常数称为分配系数(Kd)。
离子交换树脂（支持剂）。含酸性基团或碱性基团，解离出H+ 或OH-与被分离物中相应的离子交换而“挂”在树脂上。
磺酸型阳离pp子t精选交版换树脂（支持剂）
9洗脱液
ppt精选版
10
离子交换——自动分析仪
尼龙网格、烧 结玻片或其他 支持物 尽可能小的 死体积 分部收集管 4
• 柱层析：层析柱中的填充物（支持剂）都是一些 具有亲水性的不溶物质：纤维素、淀粉、硅胶等。 它们吸附一层不流动的结合水，可以看作固定相， 流过的互不溶的溶剂是流动相。
• 纸层析：滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层 用的溶剂是流动相。混合氨基酸在这两相中不断 分配而被分布在滤纸的不同位置上。只要实验条 件确定，每种氨基酸的相对迁移率恒定。分离、 鉴定氨基酸的常用技术。
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物质不仅在互不相溶的两液相间分配，也可 以在固相-液相间或在气相-液相间分配。
层析系统中的固定相可以是固相、液相或固 -液相混合相（半液体）；流动相可以是液 相或气相，它充满于静相的空隙中，并能 流过静相。
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某一物质在动相中的总量 Keff =
某一物质在静相中的总量
Keff =
第四节 氨基酸混合物的分析分离 p148
一、分配层析的一般原理
层析即色层分析又称色谱(chromatograph)。所 有层析系统均有两相组成：
固定相(stationary phase)
流动相(mobile phase)
混合物在层析系统中的分离决定于各组分在两相中 的分配。
1891年Nerst提出分配定律：当一种溶质在两种互 不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后， 溶质在两相中的浓度比为一常数称为分配系数(Kd)。
离子交换树脂（支持剂）。含酸性基团或碱性基团，解离出H+ 或OH-与被分离物中相应的离子交换而“挂”在树脂上。
磺酸型阳离pp子t精选交版换树脂（支持剂）
9洗脱液
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离子交换——自动分析仪
实验四 纸层析ppt课件
Байду номын сангаас
在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种 氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有 一定的迁移率。丙氨酸属于非极性中性氨 基酸，易溶于有机溶剂，而谷氨酸属于极 性酸性氨基酸，易溶于水，因此在纸层析 体系中谷氨酸和丙氨酸相比而言，丙氨酸 更易溶于流动相，因此迁移距离远。
本实验用圆盘滤纸进行水平型层析，
层析结束后利用氨基酸与茚三酮共加热，
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为 底物，加肝匀浆保温后，用纸层析 法检查谷氨酸的出现以证明转氨基 作用。
纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物， 滤纸纤维与水亲合力强，吸收20~22 %的 水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤 维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去， 而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所 以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相， 以有机溶剂作为流动相。
实验六 纸层析鉴定 转氨基作用
层析是利用不同物质，不同的理化性
质如吸附力、分子形状、大小、极性、分 配系数的不同而建立起来的技术。所有层 析系统都有两相组成。既固定相和流动相。 固定相既固体物质或是固定于固体物质上 的成分。流动相既可以流动的物质 如：水 或溶液等。混合物要经过此两相与其作用， 最后分离。
4、显色：将上诉滤纸平放在培养皿中，用 喷雾器喷上0.5%茚三酮溶液用热风吹，此 时可见紫色的同心圆斑出现，比较色斑的 位置和色泽的深浅，分析实验结果。
5、【计算】 分别计算各图谱的Rf值。
生成蓝紫色化合物的茚三酮法显色，观察
色斑，判定结果。
3、层析：取直径10cm圆形滤纸一张，用 圆规半径1cm同心圆，通过圆心作相互垂直 的线， 然后半径每次增加0.5cm画同心圆 至滤纸边缘。
在滤纸圆心处打一孔（如铅笔芯大小）另 取同类滤纸约1cm，下一半剪成须状，卷成 圆筒，如灯芯，插入小孔，（勿使突出滤 纸面）。将层析液放入干燥表面皿中，并 将表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤 纸平放在培养皿中，灯芯浸入溶剂中，将 另一个培养皿反盖上，可见溶剂沿芯上升 到滤纸，再向四周扩展，约25分钟后晕染 的边缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅 笔标记层析液前沿，用吹风机吹干。
在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种 氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有 一定的迁移率。丙氨酸属于非极性中性氨 基酸，易溶于有机溶剂，而谷氨酸属于极 性酸性氨基酸，易溶于水，因此在纸层析 体系中谷氨酸和丙氨酸相比而言，丙氨酸 更易溶于流动相，因此迁移距离远。
本实验用圆盘滤纸进行水平型层析，
层析结束后利用氨基酸与茚三酮共加热，
本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为 底物，加肝匀浆保温后，用纸层析 法检查谷氨酸的出现以证明转氨基 作用。
纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物， 滤纸纤维与水亲合力强，吸收20~22 %的 水。而且其中6~7 %的水是以氢键形式与纤 维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去， 而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。所 以纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相， 以有机溶剂作为流动相。
实验六 纸层析鉴定 转氨基作用
层析是利用不同物质，不同的理化性
质如吸附力、分子形状、大小、极性、分 配系数的不同而建立起来的技术。所有层 析系统都有两相组成。既固定相和流动相。 固定相既固体物质或是固定于固体物质上 的成分。流动相既可以流动的物质 如：水 或溶液等。混合物要经过此两相与其作用， 最后分离。
4、显色：将上诉滤纸平放在培养皿中，用 喷雾器喷上0.5%茚三酮溶液用热风吹，此 时可见紫色的同心圆斑出现，比较色斑的 位置和色泽的深浅，分析实验结果。
5、【计算】 分别计算各图谱的Rf值。
生成蓝紫色化合物的茚三酮法显色，观察
色斑，判定结果。
3、层析：取直径10cm圆形滤纸一张，用 圆规半径1cm同心圆，通过圆心作相互垂直 的线， 然后半径每次增加0.5cm画同心圆 至滤纸边缘。
在滤纸圆心处打一孔（如铅笔芯大小）另 取同类滤纸约1cm，下一半剪成须状，卷成 圆筒，如灯芯，插入小孔，（勿使突出滤 纸面）。将层析液放入干燥表面皿中，并 将表面皿置于直径10cm培养皿正中，将滤 纸平放在培养皿中，灯芯浸入溶剂中，将 另一个培养皿反盖上，可见溶剂沿芯上升 到滤纸，再向四周扩展，约25分钟后晕染 的边缘距滤纸边缘约1cm时即可取出，用铅 笔标记层析液前沿，用吹风机吹干。
层析技术ppt课件合集
⒉加样与洗脱
加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相 同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在 交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时 要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤 或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透 析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达 到满意的分离效果，上样量要适当，不要超 过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容 量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 1％-5％。
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体 积应足够大，一般要几十倍于床体 积，从而使分离的各峰不致于太拥 挤。②梯度的上限要足够高，使紧密 吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不 要上升太快，要恰好使移动的区带在 快到柱末端时达到解吸状态。目的物 的过早解吸，会引起区带扩散；而目 的物的过晚解吸会使峰形过宽。
液-固层析（liquid-solid chromatography）
液-液层析（liquid-liquid chromatography）
2.按层析过程的机制可分为
.吸附层析(adsorption chromatography ) ----利用吸附剂对不同组分吸附 能力的不同加以分离的方法。
.分配层析(partition chromatography ) ----利用不同组分在流动相和固定相中的 分配系数不同而进行分离的方法。
其固定相也可有两种状态，一种是以 固体作为吸附剂的固定相，另一种是以涂 布在固体载体表面的液体作为固定相。
层析
气相层析（gaschromatography）
气-固层析（gas-solid chromatography）
气-液层析（gas-liquid chromatography）
液相层析（liquidchromatography）
分配层析的一般原理
（一）分配层析的一般原理： 分配层析的一般原理：
* 分配层析：partition chromatography 分配层析： * 固定相（静相）： 固定相（静相）：stationary phase ）： 互不相溶 流动相（动相）： ）：mobile phase 流动相（动相）： * 分配系数：partition（distribution） coefficient 分配系数： （ ） Kd = CA / CB CA， CB ：物质在互不相溶的 相和 相中的浓度 物质在互不相溶的A相和 相和B相中的浓度 * 有效分配系数： 有效分配系数：
32 8 64 16 4 8 4 16 32 8 12 12 16 16 32 12 8 8 16 12 4 4 8
• 溶质的Kd越大，在流动相中的比值越大，前进越快。 溶质的Kd越大，在流动相中的比值越大，前进越快。 越大
物质在A相中的总量 物质在 相中的总量 C A· V A
K eff =
=
物质在B相中的总量 物质在 相中的总量物质Kd = 1，VA = VB 某物质Kd 1，
流动 固定 相A 相B
↓
↓
• 转移 次后，第k号管中物质的含量： 转移n次后， 号管中物质的含量： 次后 号管中物质的含量 1---- 8 2----24 ----24 3----24 ----24 4---- 8 p ,q ：物质在两相中的分数含量 Kd = q （动相）/ p （静相） 动相） 静相） T n, k = n! · p n-k+1 · q k -1 (n-k+1)! · (k-1)!
* 分配层析：partition chromatography 分配层析： * 固定相（静相）： 固定相（静相）：stationary phase ）： 互不相溶 流动相（动相）： ）：mobile phase 流动相（动相）： * 分配系数：partition（distribution） coefficient 分配系数： （ ） Kd = CA / CB CA， CB ：物质在互不相溶的 相和 相中的浓度 物质在互不相溶的A相和 相和B相中的浓度 * 有效分配系数： 有效分配系数：
32 8 64 16 4 8 4 16 32 8 12 12 16 16 32 12 8 8 16 12 4 4 8
• 溶质的Kd越大，在流动相中的比值越大，前进越快。 溶质的Kd越大，在流动相中的比值越大，前进越快。 越大
物质在A相中的总量 物质在 相中的总量 C A· V A
K eff =
=
物质在B相中的总量 物质在 相中的总量物质Kd = 1，VA = VB 某物质Kd 1，
流动 固定 相A 相B
↓
↓
• 转移 次后，第k号管中物质的含量： 转移n次后， 号管中物质的含量： 次后 号管中物质的含量 1---- 8 2----24 ----24 3----24 ----24 4---- 8 p ,q ：物质在两相中的分数含量 Kd = q （动相）/ p （静相） 动相） 静相） T n, k = n! · p n-k+1 · q k -1 (n-k+1)! · (k-1)!
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用硅藻土为载体，加固定相直接混合的办法不容 易得到均匀的混合物。为此先把硅藻土放在大量 流动相液体中，在不断搅拌下，逐渐加入固定相， 加时不宜太快，加完后继续搅拌片刻。有时因局 部吸着水分（固定相）过多，硅藻土会聚成大块， 可用玻璃棒把它打散．使硅藻土颗粒均匀，然后 填充柱管，分批小量地倒入柱中，用一端是平盘 的棒把硅藻土压紧压平，随时把过多的溶剂放出。 待全部装完后，应得到一个均匀填好的层析柱。 流动相通过时的流速与硅藻土所含的水分和固定 相有关，水分太多时流动困难。一般每克硅藻土 最多可以吸着2-3 ml水溶液，再多时流动相就不容 易通过。
反相分配柱层析中多用纤维素粉末为支持 剂，与固定相混合方法按一般操作。 通常是将选好的固定相溶剂与载体拌匀， 在布氏漏斗上抽滤除去多余的固定相后， 倒入事先选定的流动相溶剂中，剧烈搅拌 使两相互相饱和平衡，然后在层析管中加 入已用固定相饱和的流动相，按一般湿法 装柱。
2、加样 ①如样品能溶于流动相，可用少量流动相溶解， 用吸管轻轻沿管壁加于含固定相载体的上端，然 后加流动相洗脱；
3 洗脱 用流动相洗脱的方法与吸附层析法相同。 但有一点须注意，流动相溶剂在使用前 也应以固定相液予以饱和，否则层析过 程中固定相的体积会发生变化，平衡条 件就被破坏，影响分离效果。
二、载体
作为分配层析的载体需要具备的条件是: ①中性多孔粉末，无吸附作用，不溶于层析的溶 剂系统中; ②能吸着一定量的固定相，而流动相能自由通过; ③能吸着固定相的量要尽量大些，最好能达到载 体的50%以上，而流动相通过此固定相的载体的 自由容量为250-350ml/100g。 常用的载体有硅胶、硅藻土、淀粉、微晶纤维素 粉等。硅胶能吸收相当本身重量700%的水分， 此时失去了吸附性能，硅藻土可吸收100%的水 分，无系统种类很多，一般针 对欲分离物质的性质来选择：被分离的物 质是亲水性强的化合物，溶剂系统的极性 亦较强；被分离的物质是亲脂性强的，则 洗脱溶剂的亲脂性也要相对加强。 通常用的溶剂系统中固定相是极性大的溶 剂，如水缓冲溶液、甲醇、甲酰胺、丙二 醇、甘油等。流动相则为亲脂性溶剂，有 亲脂性较强和亲脂性较弱的等。一般可采 用氯仿、正丁醇、异丁醇、正戊醇、甲酚、
分配层析
分配层析法是根据一种或多种化合物，
在两种不相混合的溶剂间的分配来分 离物质的方法。相当于一种连续液一 液萃取法。
在一定温度下，物质同时溶解于两种
相接触的不相混合的溶剂中，其中一 种溶剂吸收在支持物上，作为固定相， 另一为流动相，化合物在两相中的浓 度之比是一个常数:分配系数。
原理：分配柱层析所用仪器，操作过程都与一般 吸附柱层析法相同，柱内装满某种粉末状物质的 载体，在载体的表面上保持一种液相，这种液相 并不移行，故叫固定相，将混合物样品溶液倒入 柱内后再用溶剂冲洗，此溶剂移行，故叫流动相。 冲洗时由于流动相连续加入，混合物中各成分就 一次又一次的在固定相和新的流动相中按分配系 数进行多次分配。实质上就是流动相把各成分从 固定相中连续提取出来，并向下移动，结果分配 系数大的成分移动速度大，分配系数小的成分移 动速度小，因而彼此分离。
四、欲分离的成分 用分配层析法来分离化合物的难易，主要取 决于欲分离物质间的分配系数的差值。如果 两物质间分配系数相差较大则易分离，相差 小则难分离。
通常亲水性强的化合物在以极性溶剂（如水） 为固定相，亲脂性溶剂为流动相间进行分配 柱层析时，在层析柱上移动的速度比亲水性 弱的化合物慢，化合物的亲脂性很强（如油 脂、高级脂肪酸等）在上述溶剂系统中不易 分离，可采用反相分配层析法。
一、操作步骤:
1、装柱: 分配柱层析的装柱比吸附柱层析麻烦一些，但十 分重要，直接影响分离效果。 装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤 维素等载体时，可以直接称出一定量固体，再加 入一定比例的固定相液体，混匀后按吸附剂装柱 法装入。装柱也分干法和湿法两种。 应注意的是：因为分配柱层析法使用两种溶剂， 所以事先必须先使这两个相互相饱和，即将两相 溶剂放在一起振摇，待分层后再分别取出应用。 至少流动相应先用固定相饱和后再使用；否则， 在以后洗脱时当通过大量的流动相时，就会把载 体中的固定相逐渐溶掉．最后只剩下载体，就不 成为分配色谱了。
②如样品难溶于流动相，易溶于固定相，则可用 少量固定相溶解，加少量载体拌匀吸着后装于柱 管顶端载体的上端，然后加流动相洗脱；
③如样品在两相中都不易溶解，则可用其他挥发 性溶剂溶解后，拌入干燥的载体，待溶剂挥发除 尽后，加适量(样品量的50%-100%)的固定相拌匀， 加入柱顶。样品量与载体重量之比为1∶100— 1∶1000
六、纸层析(paper
chromatography)
(一 )
为分配层析法的一种，是以滤纸为载体用来 纸层析是利用纸上吸附的水为固定相，与水 不相混合的有机溶剂为流动相从纸上流过， （又称为展开或推进），达到液-液连续萃 取的目的，使物质得到纯化或分离。
五、反相分配层析
又称逆流分配层析，是用亲脂性溶剂作固定相。极 性溶剂作流动相的分配层析法。因为和上述的两相 溶剂性质恰恰相反。故称作反相分配或逆流分配。 硅胶、硅藻土和纤维素等载体都是亲水性的物质。 一般亲脂性有机溶剂不易牢固地吸着于其表面。在 反相分配中通常是采用硅油或液体石蜡作固定相溶 剂。或者将载体硅胶中的亲水基团—OH先预以酯 化，增强它们的亲脂性。也可将硅藻土加热至 110℃冷却后置于含有二氯二甲基硅烷的干燥器中， 经如此处理后，就与非极性溶剂混合，而获得一个 吸着牢固的固定相。操作与前述相同。
分配柱层析法使混合物彻底分离的基本
条件是载体和混合物成分间根本没有任 何直接作用。特别是被分离的物质在载 体上的吸附作用是极小的。
有了这个条件，如果混合物各成分的分
配系数之间又有一定的差别，冲洗层析 柱时，就能形成纯物质的各个色层，分 离即可完全。此外，载体对所有的溶剂
应没有亲和力。