分泌物成分及测定方法

由植物根系在生命活动过程中向外界环境释放的化学物质统称为根系分泌物。

广义的根系分泌物包括活体植物根系产生的渗出物、分泌物、粘胶质以及植物残体、脱落物等的降解物，狭义的根系分泌物仅指植物通过根系分泌到土壤的各种化学物质。

从化学组成来看，根系分泌物主要是糖类、有机酸类和氨基酸类物质以及少量的脂肪酸类、固醇类、激素类、核苷酸类、黄酮类和酶类等有机物质。另外，根系分泌物在与外界进行物质和能量交换的过程中，还会有无机离子通过主动或被动方式在根际土壤与根系内部相互传递，并通过改变根际土壤的pH值和氧化还原电位间接影响植物对根际矿质营养元素的吸收和利用。

根系分泌物的收集

收集方法可归纳为三大类:

（1）植物种植在无菌水或营养液中, 收集并分析植物根系释放到溶液中的物质, 即水培的方法。水培收集比较容易, 但是否能真实反映植株在土壤中的分泌情况还需进一步考证。（2）植物种植在固体基质物上, 然后淋洗培养介质, 分析其成分, 以砂培、土培最为典型。砂培收集的根系分泌物量比水培收集的多, 这是由于根在生长过程中受到机械阻力较大造成, 但洗砂和淘砂操作比较烦琐, 而且石英砂容易滋生微生物, 会对整个培育系统造成污染。土培条件下最能反映植株在土壤中的分泌情况,但根系分泌物的原位收集检测比营养液麻烦。

3)放射性检测法( 14C 标记) 等。放射性标记法最常用的是用同位素14C 饲喂植株后收集根分泌物, 可以作定性和定量分析。

根系分泌物的收集方法

1.1.1 溶液培收集法

是指将植株苗经过胁迫处理后，用无菌蒸馏水清洗，再放入预先加入微生物抑制剂的溶

液中，使之生长一段时间，然后将植株移走，收集其培养液，过滤，确定根系释放物质，即为所收集的根系分泌物。

溶液培收集法操作简单、方便，能反映整个根系一些根系分泌物(有机酸)的变化状况。

但是，溶液培养收集法的最大问题是没有能够严格控制无菌条件。另外，该法收集时间较长，得到的根系分泌物成分多，种类复杂，很难对特定未知的分泌物进行分离鉴定。而且，溶液培养和真实生长环境有较大的差异，溶液培收集法是否能真实反映植株在土壤中的分泌情况还需进一步考证。

1.1.2基质培收集法

基质培收集和土培收集基本类似，只是植物的生长介质不同。基质培养收集根系分泌物常用的基质有石英砂、琼脂、蛭石和人造营养土等。

石英砂培收集方法是在实验处理下将植株在石英砂中进行培养一段时间后，然后用蒸馏水或是有机溶剂短时间浸泡石英砂，收集其浸泡液，再浓缩过滤即为根系分泌物。

琼脂培养收集方法是将植株幼苗置于琼脂介质中，生长一段时间后，收集根系周围以及附着在根系上的琼脂，加热溶解，过滤，收集其过滤液即为根系分泌物。

1.1.3土培收集法

土培收集根系分泌物比溶液培收集麻烦，传统的方法是将植物种植于土壤中，生长一段时间后直接获取根际土壤，将其与无菌水按一定比例混合、振荡、离心或过滤，所得滤液即为根系分泌物。

土培接近于植物自然生长状态下的实际状况，相比于溶液培养收集法，这种方法最大的优点是更能反映植株在土壤中的实际分泌情况，而且由于土壤存在机械阻力，根系分泌作用比较旺盛，土培条件下单位植株干重产生根系分泌物的量要高土培于溶液培养收集的根系分泌物的量。

1.2 连续性根系分泌物收集系统

连续性根系分泌物收集系统的工作原理一

般就是将植物移栽到底部连接到根系分泌物收

集器的培养容器中，培养过程中，植物的培养

液在向下渗流的过程中将根系分泌物先下淋

洗，使根系分泌物在收集器中被不断富集，而

培养液则又循环到培养容器中。一般使用选择

性吸附树脂柱收集根系分泌物，在收集完成后，

再用合适的洗脱剂将根系分泌物洗脱下来

根系分泌物的分离、纯化方法

根系分泌物成分复杂，直接收集的根系分泌物不能直接用于分析，必须经过预处理后才能作定性和定量分析。树脂法、衍生化与萃取法、层析法、分子膜与超速离心分离法。

根系分泌物的鉴定

1)生物测试：

根系分泌物定性半定量的测定方法,即根据某些细菌、真菌和植物幼苗对分泌物中特定成分的敏感性确定其为何物, 目前采用较少。

2)化学测试：

根据根系分泌物的物理化学反应特性确定其组成和含量。目前常用于化学测试鉴定根系分泌物的仪器有氨基酸自动分析仪(Automatic amino acid analyzer)、紫外-可见光谱(UV-VIS)、红外光谱(IR)、毛细管电泳(CK)、气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC 或RPLC)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)等。

GC-MS（气相色谱-质谱联用分析技术）是随着该领域研究逐渐深入引进的测定方法, 它具有很多的优点: ( 1) 仅需要准备极少量的样品; ( 2) 可以定性定量分析根系分泌物中各组分的结构; ( 3) 可以同时分析分泌物中所有组分。

不同类型的质谱仪的主要差别在于离子源。离子源的不同决定了对被测样品的不同要求，同时所得到信息也不同。质谱仪的分辨率也非常重要，高分辨质谱仪可以给出化合物的组成式，这对于未知物定性是至关重要的。目前，有机质谱仪主要有两大类：气相色谱-质谱联用仪和液相色谱-质谱联用仪。

根系未知根系分泌物的分离与鉴定流程：

根系分泌物→离子交换树脂→膜过滤→有机组分→萃取→色谱分离与纯品制备→有机波谱结构分析→色谱与质谱联用→波谱与色谱信息综合分析→确定未知根分泌物

根系分泌物的收集和提取

水浸提取:取生长良好的梭梭幼苗,将其无损伤从石英砂中取出,用500ml 蒸馏水浸泡石英砂24h ,浸提液离心,上清液用乙酸乙酯萃取其酸性、碱性和中性成分。方法为:

1、将离心上清液用乙酸乙酯萃取3 次(每次用乙酸乙酯10ml) ,得到乙酸乙酯相为中性

组分；

2、将水相用1M HCl 调节pH 至3 后,再用乙酸乙酯萃取3 次(每次用乙酸乙酯10ml) , 得到乙酸乙酯相为酸性组分；

3、将水相再用1M NaOH调节pH为8 ,用乙酸乙酯萃取3次(每次用乙酸乙酯10ml) ,得到乙酸乙酯相为碱性组分；

4、将酸性、碱性和中性(原液) 乙酸乙酯萃取液减压浓缩至1ml (45 ℃) ,用于进行GC/ MS 分析。

循环灌溉收集；将生长良好的梭梭幼苗培养盆下面安装一个塑料管与根系分泌物收集器相连接,通过收集器中XAD - 16 树脂吸附根系分泌物后的溶液又循环到培养盆中,如此连续循环5d后,将收集器中XAD - 16 树脂吸附的根系分泌物用甲醇洗脱,收集洗脱液为梭梭根系分泌物提取液。然后,45 ℃减压浓缩至1ml ,再用1ml 乙酸乙酯萃取,用于进行GC - MS 分析测试。