自噬检测方法
自噬的WB检测指标的研究思路及方案
自噬的WB检测指标的研究思路及方案一、技术简介1. 微管结合蛋白1A/1B-轻链3的检测目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过Western blot检测microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平，但是如果没有自噬工具药作为对照，则观察到的LC3B改变无法真实反映细胞内自噬流状态。
例如LC3B-II增加既可能是自噬活化后自噬小体增多而成，也可能是自噬溶酶体清除失败所致。
自噬流的检测方法较为复杂，单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统性检测自噬流，因此需要选择多种不同实验方法，综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。
2. 使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂，通过检测LC3B-I/II转化是自噬流检测的金指标。
当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1 (bafilomycin A1, Baf A1)刺激细胞时，细胞内自噬溶酶体降解被抑制，此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。
当细胞自噬流活化后，LC3B-II的含量会在使用Baf A1的基础上进一步增加，而当细胞自噬流阻断后，LC3B-II的含量则不会在使用Baf A1的基础上发生改变。
除Baf A1夕卜，其他一些能提高溶酶体pH 值的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测。
若待检测药物+Baf A1组LC3B-II与仅Baf A1处理组相比显著增加则代表所检测药物可以增加自噬小体或自噬溶酶体的合成。
相反，若处理组与对照组相比，LC3B-II 降低则代表处理药物减少自噬小体的合成。
3. 应用GFP-LC3B剪切实验评价自噬流GFP-LC3B融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测，还可利用溶酶体对标签蛋白的切割通过Western blot进行检测。
GFP- LC3B 蛋白进入到自噬溶酶体内后LC3B部分对溶酶体中的蛋白水解酶较为敏感，较容易被降解。
细胞自噬预实验
细胞自噬预实验化学染色法1、试验目的通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。
2、试验原理3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。
所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。
3、试验材料及试剂HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。
实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。
4、试验方法1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物处理48h。
2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。
3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。
4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。
细胞自噬检测的具体步骤及方法
细胞自噬检测的具体步骤及方法一、自噬体介绍自噬（Autophagy），或称自体吞噬，是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制而被分解的过程，该过程是一个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持一个平衡状态。
细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。
随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“自噬体（autophagosome）”。
自噬体形成后，可与溶酶体融合，自噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
自噬信号通路：二、自噬研究策略和方法正常细胞基础水平自噬活性比较低，对自噬研究通常需要进行人工调节和干预，常用药物有：1、自噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。
2、自噬抑制剂a) 自噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。
3、自噬检测1) 透射电镜；电镜作为自噬检测的金指标。
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下观察不到自噬体的形成，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。
细胞凋亡、自噬、坏死
束生命的过程。从形态学上看，首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去
微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝
聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚
集在一起，被反折的细胞膜包围。从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状
突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptotic body)；最后凋亡
一、细胞凋亡、自噬、坏死概念
细胞死亡是指细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和
功能丧失等不可逆性变化，其一般分为程序性细胞死亡和非程序细胞死亡，细胞
凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)属于前者，细胞坏死(necrosis)属于后者。
细胞凋亡是一个主动的通过调控一系列基因的活化和表达等使细胞自动结
植物）中，为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或
有缺陷的细胞器。
细胞坏死是一个被动的因极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的
细胞损伤和死亡。细胞坏死的结局与细胞凋亡类似，坏死过程中细胞膜通透性增
高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，染色质随机降解，早期核无明显形态学
变化，最后细胞破裂；另外坏死的细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，
细胞坏死
四、检测方法 细胞凋亡检测方法在之前已经讲过，此处就不列举了。 细胞自噬检测方法： 1.电镜观察：在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自 噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构， 继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体
被 双 层 膜 结 构 的 变形或肿大
自噬泡包裹，最终
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
细胞自噬诱导实验报告
细胞自噬诱导实验报告细胞自噬的实验观察，主要有四种方法。
1、提取总RNA，通过Real-time PCR 分析相关基因A TG4、A TG5和AT7G的表达；2、提取总蛋白，通过Western blotting 分析LC3的脂化；3、构建GFP-LC3表达载体，通过细胞转染利用荧光显微镜观察LC3颗粒的聚集；4、制备电镜样品，直接观察自噬体的形成。
一、pEGFP-C2-LC3质粒的提取与鉴定实验原理一、实验原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
1. 煮沸法提取质粒的原理一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。
检测自噬的实验方法
检测自噬的实验方法一、形态学检测。
1. 透射电子显微镜（TEM）- 这可是检测自噬的“金标准”呢。
就像用一个超级放大镜去看细胞内部。
自噬的时候啊，细胞里会形成自噬体，这个自噬体在TEM下有它独特的样子，双层膜结构，里面包着要降解的东西。
不过呢，TEM也有点小麻烦，它的样品制备不容易，就像做一道超级精细的菜，得小心翼翼的，而且对仪器要求也高，就像开豪车得有好的路况一样。
2. 荧光显微镜检测。
- 可以用一些标记自噬相关蛋白的荧光染料。
比如说LC3蛋白，它可是自噬的一个重要标志。
当细胞发生自噬的时候，LC3 - I会变成LC3 - II，并且会定位到自噬体膜上。
我们就可以用带有绿色荧光的标记物去标记LC3，然后在荧光显微镜下看。
就像给自噬体穿上一件绿色的小衣服，在黑暗里用特殊的灯一照就能看到啦。
这种方法相对简单一些，就像穿休闲装出门，没那么多繁琐的步骤。
二、生化检测。
1. 检测自噬相关蛋白的表达水平。
- 像Western blot就可以用来检测自噬相关蛋白的变化。
比如前面说的LC3蛋白，还有p62蛋白。
p62蛋白是自噬的底物，如果自噬正常进行，p62蛋白的水平会下降，因为它被自噬体降解了。
这就像看一个东西的库存一样，如果一直在消耗，库存就会减少。
通过检测这些蛋白的表达量的变化，就能知道自噬是不是在正常工作啦。
2. 检测自噬流。
- 可以用一些试剂来阻断自噬体和溶酶体的融合，然后看自噬相关蛋白的变化。
如果自噬流是正常的，阻断之后自噬体就会堆积，相关蛋白的表达也会有相应的改变。
这就像是在水管中间堵一下，看看水是不是真的在流，在哪个地方堵住了一样有趣呢。
细胞自噬的检测方法及原理
细胞自噬的检测方法及原理细胞自噬是一种维持细胞内稳态的重要过程，通过降解非功能性或老化的细胞器和细胞垃圾，以提供新的生物分子和能量。
自噬不仅在维持细胞内平衡方面起着关键作用，还与多种疾病的发生和发展密切相关。
因此，准确检测和探究细胞自噬的机制和功能对阐明疾病发生的分子机理具有重要意义。
目前，常用的细胞自噬检测方法主要包括观察自噬体形成和测量自噬相关蛋白水平两大类。
观察自噬体形成是一种直观和直接的方法来检测细胞自噬。
自噬体是由自噬小体和被降解的物质组成的膜包泡体，形成过程可以通过染色和显微镜技术进行观察。
以下是常用的自噬体形成检测方法：1. 电镜观察：电子显微镜技术可以观察到产生多层膜结构的自噬体。
2. 免疫荧光染色：通过特异性抗体对自噬相关蛋白进行染色，如微管相关蛋白1A/1B链轻链3（LC3）和自噬素5（Atg5），来观察细胞内自噬体的形成和分布。
3. 荧光探针染色：利用特定的荧光探针来标记自噬体，例如LC3染色剂（如LC3-GFP）和酸性小体标记剂（如LysoTracker Red）。
这些染料可以用于观察自噬体形成的时空演变过程。
4. 转基因动物模型：通过构建表达自噬相关标记物的转基因动物模型，如LC3-GFP转基因小鼠，可以观察到生物体内的自噬体形成情况。
除了观察自噬体形成，测量自噬相关蛋白水平也是评估细胞自噬活性的常用方法。
以下是常用的自噬相关蛋白水平检测方法：1. 免疫印迹：通过Western blot技术检测自噬相关蛋白的表达水平。
以LC3为例，可以检测其转化为醛固酮（LC3-I）和醛固酮转化为醛固酮（LC3-II）这一过程。
LC3-II是在自噬体形成过程中在自噬体外膜上积累的标志。
因此，检测LC3-I到LC3-II的转化可以用作自噬的指标。
2. 转基因动物模型：构建表达自噬标志物的转基因动物模型（如GFP-LC3小鼠），通过检测标志物在组织和细胞水平的表达情况来评估自噬活性。
3. 靶标免疫荧光检测：利用免疫荧光技术直接观察和测量自噬相关蛋白的表达水平，如通过LC3抗体进行染色，来检测LC3-II水平。
自噬的检测方法及其在相关疾病中的研究进展
基金项目：国家自然科学基金（２１７０７００２），大学生创新创业项目（２０１８１０３６７０４５，２０１９１０３６７０３０），蚌埠医学院２０２０年度研究生科研创新项目（Ｂｙｙｃｘ２００５４）通讯作者：赵云利【综述】自噬的检测方法及其在相关疾病中的研究进展窦婷婷，金 玲，池宇欣，赵云利（蚌埠医学院公共卫生学院，安徽蚌埠２３３０００） ＤＯＩ：１０．１６８３３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｂｍｃ．２０２１．０９．０２５ 自噬是真核细胞特有的“自食”现象，也是细胞进行自我保护的代谢途径［１］，在多细胞生物遇到危险时可进行应激与防御调控。
自噬发生时，胞内需降解的细胞器、蛋白质和部分胞质被膜包裹形成自噬体，而后与溶酶体等结合形成自噬溶酶体并对包裹内容物进行降解与回收，实现物质与细胞器的更新，维持胞内物质与能量供给的平衡［２］。
自噬在维持细胞内稳态方面发挥着重要功能：在正常生理条件下，细胞通过较低水平的自噬持续维持细胞内稳态；而在细胞遇到能量供应短缺、缺氧、雷帕霉素等因素的刺激时，启动自噬可以使细胞缓解代谢压力，维持内环境稳定［３］。
适度的自噬对维持细胞物质与能量的平衡是有益的，但过度的自我消化则会对细胞产生伤害，因此，自噬的调节有助于维持细胞的正常生理功能。
为进一步加深对自噬及其检测方法的认识，本文从自噬的基本过程、自噬的检测方法及自噬的生物学功能等几个方面对自噬进行综述。
１ 自噬的基本过程 根据自噬发生时底物进入溶酶体的途径和特点，可以将自噬分为巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬三种类型。
其中巨自噬的特征最明显，研究的也最为广泛与深入。
巨自噬是细胞质中的自噬底物被含有双层膜结构的自噬体包裹隔离，进而将自噬底物运送至溶酶体进行降解的过程。
巨自噬是一个动态的过程，包括底物的识别、自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及自噬溶酶体的降解四个不同的步骤［４］，见图１。
图１ 巨自噬的基本过程［４］１．１ 底物的识别 自噬的底物可以是衰老损伤的细胞器和折叠合成错误的蛋白质，也可以是外来侵入细胞的细菌和病毒。
细胞自噬的研究方法
细胞自噬的研究方法一、本文概述细胞自噬是一种细胞内自我降解和再循环的过程，通过这一过程，细胞能够清除受损、老化或多余的细胞器及蛋白质，从而维持细胞内部环境的稳态。
近年来，随着对细胞自噬机制的深入研究，其在生物学领域的重要性日益凸显，成为了生命科学研究的热点之一。
本文旨在探讨细胞自噬的研究方法，包括细胞自噬的监测技术、诱导与抑制方法，以及研究细胞自噬在疾病发生发展中的作用等。
通过本文的阐述，希望能为从事细胞自噬研究的科研人员提供有益的参考和借鉴，推动细胞自噬研究领域的深入发展。
二、细胞自噬的基本过程与机制细胞自噬是一种细胞内降解和回收细胞质组分和细胞器的重要过程，对维持细胞稳态和适应环境变化具有关键作用。
自噬的基本过程可以分为几个关键步骤，包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及自噬体内物质的降解。
自噬体的形成是自噬过程的起始阶段。
在这一阶段，细胞内的双层膜结构（称为吞噬泡或自噬泡）开始延伸并包裹待降解的细胞质组分或细胞器。
这一过程受到多种自噬相关基因（ATG）编码的蛋白质的调控。
一些关键的ATG蛋白，如ATG5和ATG12，参与自噬体膜的延伸和闭合。
接下来，自噬体与溶酶体融合，形成一个自噬溶酶体。
在这一步骤中，自噬体的外膜与溶酶体的膜融合，释放出自噬体内的物质进入溶酶体的酸性环境。
溶酶体中含有多种水解酶，这些水解酶能够降解自噬体内的蛋白质、脂质和糖类等有机物。
自噬体内物质的降解是自噬过程的最后阶段。
在自噬溶酶体中，水解酶将自噬体内的物质分解为小分子，如氨基酸、脂肪酸和单糖等。
这些小分子可以被细胞重新利用，以支持细胞的代谢活动和生长需求。
除了上述基本过程外，细胞自噬还受到多种信号通路的调控。
例如，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路是调控自噬的两个重要通路。
mTOR通路在营养充足时抑制自噬，而在营养不足时则促进自噬的发生。
AMPK通路则在能量不足时激活自噬，以提供能量来源。
自噬流的检测方法
自噬流的检测方法一、本文概述自噬流是一种细胞自我消化和再生的过程，对于维持细胞稳态和适应环境变化具有重要意义。
随着生物学研究的深入，自噬流的检测已成为研究细胞自噬机制的重要手段。
本文旨在综述自噬流的检测方法，包括常用的生物化学方法、显微成像技术以及基于流式细胞仪的分析等。
我们将详细介绍这些方法的原理、操作步骤、优缺点以及应用实例，以期为自噬流研究提供全面的技术支持和参考。
通过本文的阅读，读者可以深入了解自噬流检测的原理和方法，掌握自噬流研究的最新进展，为相关研究提供有益的借鉴和指导。
二、自噬流的基本概念和机制自噬流（Autophagic Flux）是细胞自噬过程的一个核心概念，它描述了从自噬体的形成、自噬底物的降解，到降解产物的再利用这一连续过程。
自噬是一种细胞内的降解途径，通过这一过程，细胞可以将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或其他细胞内组分包裹在双层膜结构的自噬体中，并运送到溶酶体进行降解，从而实现物质的循环利用和细胞的稳态维持。
自噬流的基本机制涉及多个关键步骤。
细胞在感受到饥饿、缺氧或其他压力信号时，会启动自噬过程。
随后，自噬相关基因（Autophagy-related genes, ATGs）及其产物会参与自噬体的形成。
这些自噬体通过膜延伸和闭合，将待降解的底物包裹在内。
形成成熟的自噬体后，它们会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。
在自噬溶酶体中，自噬体的内膜及其包裹的底物会被溶酶体中的水解酶降解，释放出氨基酸、脂肪酸等小分子物质。
这些降解产物随后会被细胞重新利用，以支持细胞的生存和代谢活动。
自噬流的顺畅进行对于细胞的正常生理功能至关重要。
它不仅可以清除细胞内的有害物质和受损组分，还可以为细胞提供能量和营养物质，以应对各种环境压力。
因此，研究自噬流的检测方法对于理解自噬的生理和病理作用，以及开发相关疾病的治疗策略具有重要意义。
三、自噬流检测方法的分类与特点自噬流的检测是理解自噬过程的关键环节，其方法多种多样，各具特点。
自噬研究方法及研究步骤
自噬研究方法及研究步骤自噬简介细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。
比利时科学家Christian de Duve在上世纪50年代经过电镜察看到自噬体（autophagosome）构造，并且在 1963 年溶酶体国际会议上首先提出了“自噬”这种说法。
因而Christian de Duve被公以为自噬研讨的鼻祖。
Christian de Duve 也因发现溶酶体，于1974年取得诺贝尔奖。
目前根据发生过程分为三类：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。
●大自噬（Macroautophagy）：即我们说的自噬（autophagy）;●微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式;●分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsp70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
通常说的自噬泛指Macroautophagy.自噬的过程1）：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，被称为Phagophore。
2）：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，全部揽入，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，即“自噬体”。
3）：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。
4）：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
细胞自噬相关通路关键分子的检测方法
细胞自噬是一种重要的细胞生物学过程，涉及多个关键分子和通路。
以下是一些常用的检测方法，用于研究细胞自噬相关通路的关键分子：
1. 免疫荧光染色：通过使用特异性抗体标记关键分子，然后观察其在细胞中的分布和表达水平变化。
例如，可以使用LC3B抗体来标记自噬囊泡膜结构，并观察自噬囊泡的形成和降解。
2. 免疫印迹（Western blot）：通过提取细胞蛋白质并使用特异性抗体进行免疫印迹分析，以检测关键分子的表达水平变化。
例如，可以检测LC3B-II（转化后的形式）和p62等自噬相关蛋白的表达水平。
3. 转基因小鼠模型：利用基因工程技术构建具有特定基因缺陷或突变的小鼠模型，从而研究关键分子对细胞自噬的影响。
通过对这些小鼠进行组织或细胞水平的分析，可以评估关键分子在自噬调控中的作用。
4. 实时荧光显微镜：利用荧光标记的自噬囊泡膜结构或关键分子，观察细胞内自噬过程的实时动态变化。
例如，可以使用mCherry-GFP-LC3B融合蛋白来监测自噬囊泡的形成和降解过程。
5. 基因组学和转录组学方法：通过测定关键分子的基因表达水平变化和调控机制，以了解自噬相关通路的调控网络。
这包括RNA测序（RNA-seq）和质谱法等高通量技术。
这些方法的选择取决于具体研究问题和实验要求。
综合应用多种技术可以更全面地揭示细胞自噬相关通路的关键分子的功能和调控机制。
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细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术
第２８卷第６期Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．６滨州学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｎｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ２０１２年１２月Ｄｅｃ．，２０１２细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术收稿日期：２０１２－０４－２８第一作者简介：卢建美（１９８６—），女，山东滨州人，硕士，主要从事生物化学与分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｔｅｒ．１８６０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．卢建美，赵云峰（曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜２７３１６５） 摘 要：目前普遍认为细胞的死亡途径有细胞凋亡、细胞坏死及自噬３种，其中细胞凋亡一直是医学界为治疗癌症而不懈努力研究的方向，而自噬是近几年研究的热点．现对这３种死亡方式及其各自的检测方法作一简要概述． 关键词：凋亡；坏死；自噬；检测方法 中图分类号：Ｑ ２５５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２６１８（２０１２）０６－０１１４－０７１ 凋亡、坏死及自噬的概述１．１ 细胞凋亡细胞凋亡现象由Ｋｅｒｒ在１９６５年首次发现，并在１９７２年首次提出这一概念．细胞凋亡（Ａｐｏｐｔｏ－ｓｉｓ）是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程．在细胞凋亡过程中，细胞膜反折包裹断裂的染色质片段或细胞器与胞体分离，形成众多的凋亡小体，随后凋亡小体被邻近的细胞吞噬，整个过程中细胞膜保持完整，无内容物溢出，从而不会引起炎症反应．细胞凋亡同增殖一样，是维持机体细胞数量动态平衡的基本措施．在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康．细胞凋亡调控紊乱会导致一系列疾病的发生，如自身免疫病，阿尔茨海默病等．对细胞凋亡的研究除了有助于阐明一系列免疫病的病发机制外，还能为肿瘤治疗提供新的疗法，即重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，抑制肿瘤细胞生存基因的表达，使肿瘤细胞走向凋亡，而不引起炎症反应，从而不会影响机体健康．这也正是细胞凋亡的研究如此受关注的原因．１．２ 细胞坏死细胞坏死是极端的物理化学因素或严重的病理性刺激引起的细胞损伤和死亡．坏死过程中细胞器膨胀变形，染色质随机降解，细胞膜发生渗漏，导致细胞内容物释放到胞外，从而引起炎症反应．此外，未得到及时清除的凋亡细胞也会发生胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象，即发生继发性坏死，这在体外培养细胞及巨噬细胞发生功能障碍的机体中较为常见．细胞坏死曾被认为是偶然的不能控制的退化，但近期的研究表明，细胞坏死可能是细胞“程序性死亡”的另一种形式，具有包括引发炎症反应在内的重要生理功能．当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被采用．１．３ 细胞自噬１９６２年，Ａｓｈｆｏｒｄ和Ｐｏｒｔｅｒ在人肝细胞中首次观察到自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）［１］．自噬，即自体吞噬，是一种存在于正常细胞和病态细胞中的非选择性降解机制，是细胞内长寿蛋白降解的主要途径．它的主要作用是在应激状态下为细胞生长代谢提供必要的大分子物质和能量，并清除细胞内过剩或有缺陷的细胞器．在癌症治疗中，自噬是一把双刃剑，既能抑制肿瘤细胞的生存又能产生促生存效应，造第６期卢建美，赵云峰 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术成治疗抵抗［２］．如何调节自噬使其发挥肿瘤抑制活性，成为肿瘤治疗的新靶点，这是近几年研究的热点，所以对于自噬的检测也成了一种迫切需要．１．４ 三者之间的关系细胞凋亡、坏死和自噬是３种不同的细胞死亡方式，共同维持着机体的自我平衡，在肿瘤发生发展中起重要的作用．一直以来，自噬被认为是一种细胞生存的机制，随着研究的深入，发现自噬具有双重性，首先是作为细胞的保护机制防止细胞死亡，但是当自噬达到一定水平就会促使细胞走向凋亡［３］．因此自噬通常先于凋亡，进而启动凋亡．而当发生凋亡的细胞未得到及时清除时便会导致继发性坏死，出现胞膜破裂溶解、胞浆外泄并引发炎症反应的现象．研究发现其机制为ｃａｓｐａｓｅ酶能切割与自噬有关的蛋白Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇ５、Ａｔｇ４Ｄ，导致Ｂｅｃｌｉｎ１及Ａｔｇ５失去自噬诱导活性，而发挥促凋亡作用［４］．切割后的Ａｔｇ４Ｄ自噬活性及促凋亡活性均增加［５］．由此细胞从自噬走向凋亡．凋亡可以抑制坏死．坏死与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）导致的ＡＴＰ过度消耗及其产物介导的线粒体凋亡诱导因子释放有关．凋亡时激活的ｃａｓｐａｓｅ面每切割ＰＡＲＰ使其失活，从而抑制ＡＴＰ的过度消耗，防止坏死发生［６］．王晓东等人发现了诱导细胞坏死的关键蛋白ＲＩＰ３［７］，并发现ＲＩＰ３蛋白表达量的高低是控制细胞凋亡或细胞坏死的关键，如果ＲＩＰ３表达量高，细胞则走向坏死；ＲＩＰ３表达量低，细胞则走向凋亡．由此可见，三者之间的关系是比较复杂的，三者之间相互协调，共同维持机体结构及功能的稳定．２ 检测方法细胞凋亡、坏死及自噬无论在生化代谢途径，还是形态学方面都有显著的区别，可以根据其各自的特点，运用一定的检测手段将其区分开来．２．１ 细胞凋亡检测２．１．１ 细胞凋亡的形态学检测方法凋亡细胞会发生形态学上的改变，一般认为凋亡细胞的形态学改变是判断其凋亡的基础．在光学显微镜下可以观察到凋亡细胞大体形态的改变，如贴壁生长的凋亡细胞外形皱缩、圆化，细胞的体积变小，凋亡晚期可以观察到凋亡小体．经吖啶橙或Ｈ３３２５８染色后，在荧光显微镜下可以观察到活细胞核染色质呈现均匀分布的黄绿色或蓝色荧光，而凋亡细胞核染色质的荧光浓聚在核膜内侧，因此凋亡细胞核的特征性形态可以被清晰地辨认．在电子显微镜下可以清晰地观察到凋亡细胞超微结构的改变，如细胞表面微绒毛消失，核染色质凝聚、边缘化，细胞器集中，胞膜起泡．凋亡晚期的细胞可观察到凋亡小体或可见凋亡小体被邻近巨噬细胞吞噬的现象．激光共聚焦显微镜除用于普通形态学观察外，还可以对凋亡细胞内的大分子进行初步定位［８］．实验证实１０μｍｏｌ／Ｌ的ＭＭＰＴ作用于Ｈ１７９２细胞４８ｈ后，倒置相差显微镜下可以观察到凋亡小体及胞膜起泡，荧光显微镜下部分细胞呈现明显的染色质凝集现象［９］．此外利用荧光显微镜还可以定性地观察转染效率的高低［１０］．形态学观察法与其他方法相比更形象、更直观、更容易被接受．一般实验研究的首选是进行形态学检测．电镜形态学观察曾一度被认为是判断凋亡最经典、最可靠的方法，是鉴定细胞凋亡的金标准［１１］．然而形态学检测法也有一定的局限性，如只能定性不能定量，且在判定时存在一定的主观性．另外，扫描电镜及透射电镜的样品处理过程比较繁琐，且价格昂贵．２．１．２ 凋亡细胞的ＤＮＡ检测分析细胞凋亡的一个最主要特征是ＤＮＡ发生核小体间的断裂，产生含有不同数量核小体单位的片段，大小为１８０～２００ｂｐ的整数倍，在进行琼脂糖凝胶电泳时就形成了特征性的梯状条带（ＤＮＡｌａｄｄｅｒ）．但是当凋亡细胞数量少无法直接应用琼脂糖电泳观察凋亡细胞核ＤＮＡ的变化时，可以通过连接介导的ＰＣＲ专一性地扩增核小体的梯形片段再进行琼脂糖电泳，从而提高检测的灵敏度．此外，对凋亡细胞ＤＮＡ的检测分析还包括ＤＮＡ末端标记检测：原位切口平移（ＩＳＮＴ）和ＤＮＡ断裂的原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）．其原理都是将标记的核苷酸连接到断裂ＤＮＡ的３’羟基末端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果．酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）也是常用的检测细胞凋亡的方法，其原理是在吸附有组蛋白抗体的微孔板上加入核小体５１１滨州学院学报第２８卷上清液，核小体组蛋白与抗体结合，当加入过氧化物酶标记的ＤＮＡ抗体后，它们与核小体上的ＤＮＡ结合，并对过氧化物酶底物产生显色反应，再用酶标仪对凋亡细胞进行定量分析．罗迪贤等人证实ＴＯＦＡ和ＤＮＲ处理的细胞经琼脂糖凝胶电泳后，其ＤＮＡ出现特征性的梯状条带［１２］．ＴＵＮＥＬ染色后，经电针刺处理的小鼠大脑皮层变薄并伴有局部神经元丢失［１３］．经ＥＬＩＳＡ法证实，随着ＭＭＰＴ作用时间的延长和药物浓度的增加，肺癌Ｈ１７９２细胞内核小体水平逐渐升高，表明凋亡细胞数逐渐增加［９］．ＤＮＡ检测分析与电镜检测法一样也被认为是判断细胞凋亡的金标准，但是它只能对晚期凋亡细胞进行检测．琼脂糖凝胶电泳法简单易行，但灵敏度不高，且需要的细胞数量较多．ＴＵＮＥＬ荧光素标记法灵敏度高，且可以测定在细胞周期中ＤＮＡ发生断裂的具体时相，但是不能检测只发生ＤＮＡ大片段断裂的凋亡细胞，不能定量，且容易出现坏死细胞的假阳性．ＥＬＩＳＡ法不需要特殊仪器，但不能精确测定凋亡发生的绝对量．２．１．３ 细胞凋亡相关基因的表达检测细胞凋亡时有些基因表达异常，这些基因的产物促进或抑制凋亡发生．因此检测这些基因的表达也成了确定细胞是否发生凋亡的手段之一．基因的表达包括转录和翻译两个过程，因此可以分别从转录水平和翻译水平进行检测．（１）相关基因转录水平的检测①ＲＴ－ＰＣＲ检测凋亡相关基因的表达变化细胞发生凋亡时，细胞内如Ｂｃｌ－２家族、Ｃａｓｐａｓｅ家族成员表达异常，可以用ＲＴ－ＰＣＲ对这些基因的表达进行半定量测定．首先提取细胞总ＲＮＡ，并添加要检测基因及内参基因的引物，进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，随后通过琼脂糖凝胶电泳进行半定量检测［１４－１５］．②荧光定量ＰＣＲ检测细胞凋亡近年来，实时荧光定量ＰＣＲ作为一种新的技术在检测基因表达水平方面得到了广泛的应用，与ＲＴ－ＰＣＲ相比，其具有操作简单，反应快速，灵敏度高等优点．原理是ＰＣＲ扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团．探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，Ｔａｑ酶的５’端～３’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现荧光信号的累积与ＰＣＲ产物形成完全同步．步骤是提取细胞总ＲＮＡ，设置反转录反应体系反转录成ｃＤＮＡ，取１μＬ ｃＤＮＡ，加入Ｔａｑ酶等进行实时荧光定量ＰＣＲ扩增，根据得到的ＣＴ值分别与其相对应的内参（一般为β－ａｃｔｉｎ）的ＣＴ值相减进行校正得到校正ＣＴ值，从而相对定量计算ｍＲＮＡ含量［１６］．（２）相关基因翻译水平的检测①酶活检测凋亡有３条信号通路，每条通路都有其特征性酶，如ｃａｓｐａｓｅ４或ｃａｓｐａｓｅ１２是内质网通路特有的酶，而ｃａｓｐａｓｅ９为线粒体途径所特有，因此检测这些特征性的酶对于确定具体的凋亡途径具有重要的意义．对于酶活检测，可以选用特定的试剂盒，如碧云天的ｃａｓｐａｓｅ４试剂盒，原理是ｃａｓｐａｓｅ４能催化底物Ａｃ－ＬＥＶＤ－ｐＮＡ产生黄色的ｐＮＡ，用分光光度计或酶标仪测ｐＮＡ在４０５ｎｍ处的吸光度，根据标准曲线换算成酶活力单位．②Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测蛋白表达Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ又称蛋白质印迹，是一种蛋白质的固定和分析技术，现在被广泛用于检测蛋白水平的表达．将已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活性，第一抗体与特异性抗原决定簇结合，再用荧光标记（用同位素或非同位素）的第二抗体来检测．③免疫组化免疫组化与Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ一样，也是利用了抗原与抗体特异性结合的免疫学原理，它通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，以此对组织细胞内抗原其进行定位、定性及定量研究．一般要用到石蜡切片技术．经ＲＴ－ＰＣＲ和ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示，二甲胂酸通过调节鼠表皮细胞内Ｂｃｌ－２、Ｂａｄ和ｃａｓｐａｓｅ１２的ｍＲＮＡ水平和蛋白表达水平来诱导凋亡［１７］．而ＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ通过Ｂｃｌ／Ｂａｘ—ｃａｓｐａｓｅ９—ｃａｓｐａｓｅ３途径抑制ｏｘ－ＬＤＬ诱导的脐静６１１第６期卢建美，赵云峰 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术脉内皮细胞凋亡［１８］．通过检测细胞内特定基因的表达变化可以明确细胞的凋亡途径．荧光定量ＰＣＲ与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交相比更快更准确，能显著提高检测的特异性和灵敏度，同时，它要求操作也必须非常精确．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测法灵敏度高，但是只能做半定量分析，且部分药品毒性较大．２．１．４ 凋亡细胞的流式细胞仪检测流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置，是现代高科技多学科高度发展、综合的结晶，是目前定量测定细胞凋亡的重要方法之一．细胞凋亡时的许多特征性变化都可以用流式细胞仪检测出来．（１）磷脂酰丝氨酸外翻检测用荧光素ＦＩＴＣ标记的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ进行磷脂酰丝氨酸外翻检测．Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ是一种Ｃａ２＋依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合．正常细胞的磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内侧，荧光素ＦＩＴＣ标记的Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ不能与ＰＳ结合．而凋亡早期，细胞的磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜表面，从而能与Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ特异性结合．坏死细胞由于胞膜不完整，Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ也可以与ＰＳ结合．为了将凋亡与坏死区分开来，一般采用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ与ＰＩ双染．ＰＩ是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，因此可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来．即正常活细胞为Ａｎｎｅｘｉｎ－／ＰＩ－均低染；凋亡细胞Ａｎｎｅｘｉｎ＋高染、ＰＩ－低染；继发性坏死细胞Ａｎｎｅｘｉｎ＋／ＰＩ＋均高染．（２）凋亡细胞的ＤＮＡ检测ＰＩ虽不能透过完整的细胞膜，但经打孔后可以进入细胞插入到ＤＮＡ碱基对之间，用流式细胞仪检测掺入的ＰＩ荧光强度，即为ＤＮＡ含量．细胞凋亡时，ＤＮＡ发生断裂，膜通透性升高，一部分小分子ＤＮＡ可透出细胞外，使细胞内ＤＮＡ含量低于正常细胞，故在正常的Ｇ０／Ｇ１峰前常有一亚二倍体峰出现［１９］，即为凋亡峰（ＡＰ峰）．根据亚二倍体峰的高低可计算出凋亡细胞百分率．（３）凋亡细胞的周期检测利用流式细胞仪还可以检测出某种药物使细胞周期阻滞于哪个时期，来确认处于什么周期的细胞更易发生凋亡．如盐霉素可以使经辐射处理的癌细胞阻滞于Ｇ２期［２０］，而经表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）处理的ＨＴ－１０８０细胞停滞于Ｇ０／Ｇ１期［２１］．此外，利用流式细胞仪还可以对细胞进行线粒体膜电位及细胞内氧化还原态的检测等．流式细胞仪检测显示，盐霉素能使经辐射处理的癌细胞阻滞在Ｇ２期，且能引起ＤＮＡ片段化［２０］．通过Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ双染显示Ｈ２Ｏ２能有效诱导树突状细胞走向凋亡，为治疗植物抗宿主病及自身免疫病等提供了新的方向［２２］．流式细胞仪常用作细胞凋亡的定量分析，具有简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点，可以分别从ＤＮＡ及膜分子水平进行多方位的检测．但是也存在一定的局限性，如检测中漏检率和错检率很高，周期检测时固定过程难控制等．２．２ 细胞坏死检测２．２．１ 形态学检测方法同凋亡一样，坏死的细胞也有其独特的形态学变化．借助显微镜可以观察到坏死细胞体积及细胞器肿胀，细胞核稀疏成网状，细胞膜破裂引起内容物外溢等现象．２．２．２ ＤＮＡ检测分析细胞坏死的另一特点是染色质随机降解．因此ＤＮＡ电泳条带呈弥散状，而非规则的梯状条带．２．２．３ ＰＩ染色法通常采用Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ和ＰＩ双标法对凋亡细胞与坏死细胞加以鉴别．凋亡早期，磷脂酰丝氨酸外翻，但膜具有完整性，因此凋亡细胞呈Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ单标阳性．坏死细胞膜不具完整性，呈Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ和ＰＩ双染阳性．同凋亡不同，细胞坏死会引发周围组织发生炎症反应，不利于机体健康，因此单独研究坏死的文献较少．根据细胞坏死特征所采用的检测方法可以将细胞坏死与凋亡区分开来．２．３ 细胞自噬检测２．３．１ 自噬泡的观察透射电子显微镜的超微结构观察一直被认为是检测自噬的金标准［２３］．在透射电子显微镜下，可以观察到自噬的特征性变化即自噬泡及自噬溶酶体形成的全过程．首先在肿胀变形的细胞器周围出现双层膜空泡状结构，继而包裹待降解物质形成自噬体，随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体．７１１滨州学院学报第２８卷透射电镜观察显示，暴露在香烟中的部分卵泡上皮细胞发生自体吞噬，细胞内形成许多清晰可见的自噬泡［２４］．而Ｐ５３靶基因ＩＳＧ２０Ｌ１敲除能降低细胞自噬泡水平［２５］．透射电镜观察结果形象、直观，甚至可以观察到自噬的全过程，但是存在一定的主观性，且样品处理过程比较繁琐，价格昂贵．２．３．２ 单丹（磺）酰戊二胺染色法单丹（磺）酰戊二胺（ＭＤＣ）染色法是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种非特异的检测自噬体方法．ＭＤＣ是自噬囊泡示踪剂，能与自噬囊泡膜上的Ａｔｇ８特异性结合，因此其阳性结构可代表自噬囊泡［２６］，在荧光显微镜下可观察自噬囊泡的数量．顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后，用ＭＤＣ对自噬囊泡染色，结果显示实验组自噬泡数量明显高于对照组，而经自噬抑制剂３－ＭＡ诱导后，自噬泡数量照组的５０％左右［２７］．由于ＭＤＣ染色法不具有自噬特异性，且假阳性较高，因此只有当自噬效应得到了肯定后，用此方法分析效应强度才有意义．２．３．３ 自噬体膜上标志性蛋白质检测微管相关蛋白１的轻链３（ＬＣ３）是目前检测自噬的唯一标志蛋白［２８］，定位在自噬体分隔膜上，在自噬体形成各阶段的内外膜及自噬溶酶体膜上也可见到．通过与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）结合来示踪自噬形成．在正常细胞中，自噬特异性蛋白ＬＣ３呈低水平表达，且均匀地弥散在胞浆中，在荧光显微镜下呈现均匀的绿色荧光．而细胞发生自噬后，ＬＣ３表达增加并转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，斑点的个数用来评价自噬活性的高低［２９］．用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法可以检测细胞内ＬＣ３的相对含量，评价自噬水平．激光共聚焦显微镜检测显示，低氧条件下内皮细胞内含ＬＣ３－ＧＦＰ颗粒的自噬小体明显增多［３０］．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测显示顺铂作用于食管鳞状上皮细胞后，实验组Ｂｅｃｌｉｎ １与ＰＩＫⅢ含量明显升高，而加入自噬抑制剂３－ＭＡ诱导后能恰好抵消Ｂｅｃ－ｌｉｎ １与ＰＩＫⅢ表达的上调，且能降低ＬＣ３－Ⅰ的含量及减少ＬＣ３－Ⅰ向ＬＣ３－Ⅱ的转变［２７］．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测法特异性强，灵敏度高，但是只能做半定量分析，且部分药品毒性较大．此外还有间接自噬体检测法、吖啶橙染色法等．３ 结语由于不同药物触发的细胞死亡途径有多种，而每种检测方法也都有一定的局限性，因此在研究某一药物的作用机制时可以同时采用多种检测方法．例如在测定细胞活力时可采用四唑盐比色实验，也可以采用染料排斥实验进行细胞计数绘制生长曲线．在检测细胞内凋亡蛋白ｃａｓｐａｓｅ酶的表达时，可以用ＲＴ－ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ半定量测定其ｍＲＮＡ含量，也可以采用试剂盒直接测定该酶的活性或用免疫印迹实验在翻译水平测定其蛋白表达量．在检测细胞核的凋亡变化时，可以通过吖啶橙或Ｈ３３２５８染色对凋亡细胞核进行形态学观察，也可以通过琼脂糖凝胶电泳对ＤＮＡ进行定性分析．总之药物作用机制的检测方法有很多，在实验过程中应该根据具体情况及实验目的进行筛选．细胞是一个复杂的有机体，凋亡、坏死及自噬是细胞自我调控维持机体稳定的３种形式，研究其各自的检测方法有助于为癌症及肿瘤治疗提供可靠的依据．目前对细胞的这３种调控方式已日渐明朗，检测手段也日益成熟，但是对三者之间的相互关联的分子机制还知之甚少．受刺激诱导以后，细胞又是如何特异性地选择了其中之一走向了死亡，还有待进一步研究．参 考 文 献：［１］ Ａｓｈｆｏｒｄ Ｔ Ｐ，Ｐｏｒｔｅｒ Ｋ Ｒ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２：１９８－２０２．［２］ Ｃｈｅｎ Ｎｉｎｇ，Ｖａｓｓｉｌｉｋｉ Ｋａｒａｎｔｚａ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１１（２）：１５７－１６８．［３］ Ｖｉｃｅｎｃｉｏ Ｊ Ｍ，Ｇａｌｌｕｚｚｉ Ｌ，Ｔａｊｅｄｄｉｎｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ？Ｗｈｅｎ ａ ｄａｍａｇｅｄ８１１第６期卢建美，赵云峰 细胞凋亡、坏死、自噬的检测方法与技术ｃｅｌｌ ｍｕｓｔ ｄｅｃｉｄｅ ｉｔｓ ｐａｔｈ－ａ ｍｉｎｉ－ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ，２００８，５４（２）：９２－９９．［４］ Ｋａｂｅｙａ Ｙ，Ｋａｍａｄａ Ｙ，Ｂａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｔｇ１７ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｔｇ１ａｎｄ ａｔｇ１３ｉｎ ｙｅａｓｔａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５，１６（５）：２５４４－２５５３．［５］ Ｄｊａｖａｈｅｒｉ－Ｍｅｒｇｎｙ Ｍ，Ｍａｉｕｒｉ Ｍ Ｃ，Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ．Ｃｒｏｓｓ ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｂｙｃａｓｐａｓｅ－ｍｅｄｉｕａｔｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｂｅｃｌｉｎ－１［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１０，２９（１２）：１７１７－１７１９．［６］ Ｚｏｎｇ Ｗ Ｘ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ．Ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｄｅａｔｈ ａｓ ａ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，２００６，２０（１）：１－１５．［７］ Ｈｅ Ｓｕｄａｎ，Ｗａｎｇ Ｌａｉ，Ｍｉａｏ Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－３ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｎｅｃ－ｒｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＴＮＦ－α［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００９，１３７（６）：１１００－１１１１．［８］ Ｓｕｎ Ｈｏｎｇｘｉａ，Ｘｉａ Ｑｉａｎｇ，Ｔａｎｇ ｗｅｎｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｎｉｃｋｅｌ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｅｍｏｃｙｔｅｓｏｆ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）ｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１０，５５：３９０－３９７．［９］ Ｚｈａｏ Ｙｕｎｆｅｎｇ，Ｌｉ Ｘｉｕｌａｎ，Ｈｕ Ｚｕｎｌｉ，ｅｔ ａｌ．ＭＭＰＴ：ａ ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ Ｈ１７９２ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｆａｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＩｎｖｅｓｔＮｅｗ Ｄｒｕｇｓ，２０１０，２８：３１８－３２５．［１０］ 孙威，刘宝林．靶向Ｐｌｋ１的ｓｉＲＮＡ对肝癌细胞凋亡的影响［Ｊ］．世界华人消化杂志，２０１１，１９（２７）：２８２２－２８２８．［１１］ Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｍ Ｍ，Ｃｉｄｌｏｗｓｋｙ Ｊ Ａ．Ｒａｐｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｒａｔ ｌｙｍ－ｐｈｏｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８６，１１８：３８－４５．［１２］ 罗迪贤，李波平，高治平．ＴＯＦＡ协同柔红霉素诱导肠癌细胞株ＨＣＴ－８细胞凋亡［Ｊ］．中南医学科学杂志，２０１１，３９（５）：５１４－５２１．［１３］ Ｚｈａｏ Ｊｉａｎｘｉｎ，Ｔｉａｎ Ｙｕａｎｘｉａｎｇ，Ｘｉａｏ Ｈｏｎｇｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｏｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌａｎｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａ－ｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１１，３１（４）：３４９－３５５．［１４］ 胡志坚，江永青．ｓｉＲＮＡ抑制ＮＦＢＤ１基因表达对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞凋亡的影响［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２０１１，２１（１０）：２３７３－２３７６．［１５］ 贾广乐，王众．镉诱导大鼠肾细胞凋亡及其机理的研究［Ｊ］．生态毒理学报，２００８（３）：２６８－２７３．［１６］ 郭晓慧，于小玲．实时荧光定量ＰＣＲ法检测卵巢良、恶性肿瘤中Ｉｄ１ｍＲＮＡ的表达［Ｊ］．现代肿瘤医学，２０１１，１９（１１）：２２９９－２３０１．［１７］ Ｋｉｍ Ｅｕｎｊｕ，Ｋｉｍ Ｍｉｎｊｅｏｎｇ，Ｓｕｎｇ Ｋｙｕｎｇｈｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ［Ｊ］．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１２，８８（５）：６７２－６７７．［１８］ Ｗｕ Ｃｈｕｎｙａｎ，Ｔａｎｇ Ｚｈｉｈａｎ，Ｊｉａｎｇ Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．ＰＣＳＫ９ｓｉＲＮＡ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＨＵＶＥＣ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙｏｘ－ＬＤＬ ｖｉａ Ｂｃｌ／Ｂａｘ—ｃａｓｐａｓｅ９—ｃａｓｐａｓｅ３ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２，３５９（１－２）：３４７－３５８．［１９］ Ｎａｄｉａ Ｚｅｐｅｄａ，Ｓａｎｄｒａ Ｓｏｌａｎｏ，Ｎａｔａｌｉａ Ｃｏｐｉｔｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ＣＤ４（＋），ＣＤ８（＋），ＣＤ１９（＋）ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ ｉｎｆｅｃ－ｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ Ｒｅｓ，２０１０，１０７：１１２９－１１３５．［２０］ Ｋｉｍ Ｗｏｎ Ｋｉ，Ｋｉｍ Ｊｕｈｗａ，Ｙｏｏｎ Ｋｙｕｎｇｓｉｌ，ｅｔ ａｌ．Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ，ａｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｇ２ａｒｒｅｓｔ［Ｊ］．Ｉｎｖｅｓｔ ＮｅｗＤｒｕｇｓ，２０１１，４：４１１－４１９．［２１］ Ｌｅｅ Ｍｉｈｅｅ，Ｈａｎ Ｄｏｎｇｗｏｏｋ，Ｈｙｏｎ Ｓｕｏｎｇｈｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ＨＴ－１０８０ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ－３－Ｏ－ｇａｌｌａｔｅ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ９１１滨州学院学报第２８卷Ｂｃｌ－２ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒκＢ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０１１，１６：７５－８５．［２２］ 刘鑫，庞铁光，姚闯，等．ＤＣ凋亡的流式细胞术分析［Ｊ］．内蒙古民族大学学报，２０１０，１６（５）：１０９－１１０．［２３］ Ｍａｒｔｉｎｅｔ Ｗ，ＤｅＭｅｙｅｒ Ｇ Ｒ，Ａｎｄｒｉｅｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２００６，５４（１）：８５－９６．［２４］ Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅ，Ｌｉｅｓｂｅｔｈ Ａｌｌａｉｓ，Ｓａｓｋｉａ Ｌｉｐｐｅｎｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｌｅ－ｕｍ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈｅｓ［Ｊ］．Ｈｉｓｔｏ－ｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１２，１３７：２９３－３０１．［２５］ Ｋａｔｈｒｙｎ Ｇ Ｅｂｙ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｍ Ｒｏｓｅｎｂｌｕｔｈ，Ｄｅｂｏｒａｈ Ｊ Ｍａｙｓ，ｅｔ ａｌ．ＩＳＧ２０Ｌ１ｉｓ ａ Ｐ５３ｆａｍｉｌｙ ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，９：２５－２６．［２６］ 张石云，段振玲，徐琳，等．顺铂诱导卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞自噬和凋亡的研究［Ｊ］．现代妇产科进展，２０１１，２０：４５－４７．［２７］ Ｌｉｕ Ｄｏｎｇｌｅｉ，Ｙａｎｇ Ｙａｎｇ，Ｌｉｕ Ｑｕａｎ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｂｙ ３－ＭＡ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ，２０１１，２８：１０５－１１１．［２８］ 齐亚莉，王俊，李岩，等．自噬体的检测及其对肿瘤的作用［Ｊ］．中国实验诊断学，２０１０，１４：７８０－７８２．［２９］ 方永奇，刘林．神经细胞自噬的研究进展［Ｊ］．中华中医药学刊，２０１１，２９：４５３－４５５．［３０］ 张瑞光．低氧微环境下内皮细胞自噬与凋亡之间作用的研究［Ｄ］．武汉：华中科技大学，２０１１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ＡｕｔｏｐｈａｇｙＬＵ Ｊｉａｎ－ｍｅｉ，ＺＨＡＯ Ｙｕｎ－ｆｅｎｇ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｑｕｆｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｕｆｕ２７３１６５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏｗａｄａｙｓ，ｉｔ ｉｓ ｗｉｄｅｌｙ ｂｅｌｉｅｖｅｄ ｔｈａｔ ｃｅｌｌ ｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｗａｙｓ：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈ－ａｇｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｍａｋｅ ｕｎｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｅｆｆｏｒｔｓ ｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃａｎｃｅｒ，ｗｈｉｌｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ ａｎｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈｏｔｓｐｏｔ ｓｔａｒｔｅｄ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ．Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｇｅｎｅｒ－ａｌｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅｓｅ ｔｈｒｅｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｎｅｃｒｏｓｉｓ；ａｕｔｏｐｈａｇｙ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ（责任编辑：贾晶晶）０２１。
自噬荧光研究方法及具体步骤
自噬荧光研究方法及具体步骤自噬（Autophagy）一词来源于古希腊语，是“auto”（自我）与“phagein”（吞噬）的结合。
自噬发生在细胞内，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器，使其包被进入双层膜囊泡（自噬体），进而与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，自噬的意义在于实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
在自噬过程中，自噬体的形成是关键，其直径平均500nm，囊泡内包裹胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。
与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。
细胞质中的线粒体等细胞器首先被囊泡所包被，这种囊泡主要来自于内质网和高尔基体；囊泡最终形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）；自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡，最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。
自噬观察检测方法：1．透射电镜下直接观察自噬体Phagophore 的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜；自噬体的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等；自噬溶酶体的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
2．利用Western Blot 检测LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成过程中，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一段多肽，转变为膜型LC3 （LC3-II）。
故而LC3-II/LC3-I 比值的大小可估计自噬水平的高低。
3．在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
单荧光检测系统该系统通过外源表达系统在宿主细胞中过表达GFP-LC3B 融合蛋白。
线粒体自噬实验研究步骤
线粒体自噬实验研究步骤一、实验准备1. 实验设备：显微镜、细胞培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备等。
2. 实验试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、线粒体自噬相关抗体、荧光标记二抗、细胞凋亡检测试剂盒等。
二、细胞处理1. 细胞传代：将细胞从培养瓶中吹散，加入适量培养基，离心后重新悬浮于培养基中，接种到培养皿或培养瓶中，放入细胞培养箱中进行培养。
2. 细胞同步化：为了使实验结果更加准确，需要对细胞进行同步化处理。
常用的方法包括饥饿法、血清法等。
3. 药物处理：根据实验设计，向细胞中加入相应的药物或抑制剂，处理一定时间后，收集细胞样本进行下一步实验。
三、样本制备1. 细胞爬片：将细胞接种到涂有抗凝剂的载玻片上，培养一定时间后进行固定。
2. 细胞染色：采用荧光染色或免疫组化染色等方法，对细胞进行标记和染色。
3. 制作切片：将染色后的细胞进行切片，制备成临时装片或石蜡切片。
四、显微观察1. 荧光显微镜观察：利用荧光显微镜观察荧光染色标记的细胞样本，观察线粒体自噬的情况。
2. 倒置显微镜观察：利用倒置显微镜观察细胞的生长状态和形态变化。
3. 激光共聚焦显微镜观察：利用激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光信号和定位情况。
五、数据分析1. 图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察到的图像进行分析，测量线粒体自噬的相关参数，如自噬体数量、大小等。
2. 定量分析：采用定量PCR、Western blot等方法对实验数据进行定量分析，比较不同处理组之间的差异。
3. 统计分析：采用统计软件对实验数据进行统计分析，计算相关指标和参数，比较不同处理组之间的差异显著性。
六、结果解读根据实验结果，分析线粒体自噬在相关生理或病理过程中的作用和机制，探讨其与疾病的关系，为进一步的研究和应用提供理论依据。
七、实验总结根据实验结果和数据分析，总结实验结论，评估实验的优缺点，提出改进意见和建议，为后续的研究和应用提供参考和借鉴。
检测细胞自噬的方法
检测细胞自噬的方法
检测细胞自噬的方法主要包括以下三种：
1. 透射电镜法：自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
2. 荧光显微镜观察法：LC3全称MAP1LC3，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。
其中，LC3B应用广泛。
自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低。
因此，可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。
3. Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量：利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成。
自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。
因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计自噬水平的高低。
请注意，以上方法可能受到多种因素的影响，例如样本的来源、处理方法、检测条件等。
在进行自噬检测时，建议按照操作规程仔细操作，以保证结果的准确性和可靠性。
同时，建议在进行自噬检测时参考相关文献，以获得更全面的信息。
铁自噬检测指标-概述说明以及解释
铁自噬检测指标-概述说明以及解释1.引言概述部分的内容如下：1.1 概述铁自噬是细胞内一个重要的调节过程，通过将细胞内的铁物质包裹并运输至溶酶体进行降解，从而维持细胞内铁离子的稳态平衡。
这一过程在细胞内的生理功能、代谢调控、抗氧化应激等方面扮演着重要角色。
近年来，随着对铁自噬的研究深入，越来越多的证据表明铁自噬与多种疾病的发生发展密切相关，如铁代谢紊乱所导致的血液疾病、神经系统疾病和肿瘤等。
本文旨在介绍铁自噬检测指标，通过对铁自噬的定义、重要性以及相关研究的综述，来使读者了解铁自噬在细胞生物学中的重要性和潜在应用。
在正文部分，将详细介绍铁自噬的基础指标和新兴指标，并讨论它们在相关研究中的应用。
此外，本文还将对如何进行指标的评估进行探讨，包括实验设计、数据分析和结果解释等方面。
总的来说，本文将通过系统的论述和整理来展示铁自噬检测指标的研究进展，并为读者提供对铁自噬进行深入理解和研究的基础知识，以期对相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。
最后，结论部分将对整篇文章进行总结回顾，并对未来的研究方向进行展望，以期为相关领域的研究者提供参考。
【2. 正文】...【1.2 文章结构】本文按以下结构进行组织和呈现：1. 引言：首先，我们将对铁自噬检测指标这一主题进行概述，介绍其重要性，并总结相关研究。
2. 正文：接下来，我们将深入探讨铁自噬的定义、其在生物体内的重要性以及目前的研究进展。
随后，我们将重点介绍不同的检测指标，包括基础指标和新兴指标，并探讨它们在铁自噬研究中的应用。
3. 指标评估：在本节中，我们将详细描述铁自噬检测指标的实验设计方法，包括涉及的样本处理、数据分析和结果解释方法，以确保可靠性和准确性。
4. 结论：最后，我们将对全文进行总结回顾，展望未来的研究方向，并得出关于铁自噬检测指标的结论。
通过以上结构的安排，本文将全面介绍铁自噬检测指标的相关背景、定义、重要性、研究进展、应用以及评估方法。
希望本文能为读者提供关于铁自噬检测指标的全面了解，并为今后的研究提供有价值的参考依据。
细胞自噬检测
2、5 细胞裂解细胞从培育皿上被刮下来以后 ,在 15ml 灭菌塑料试管顶用 PBS 清洗 3 次,每次清洗用 10mlPBs 充足重悬细胞 ,在 4“c下 5009 离心 5min。
全部操作在冰长进行。
最后一步清洗把细胞转移到 1、smlePpendorf管中。
把细胞充足重悬在 TAP 细胞裂解液中。
依据细胞量决定裂解缓冲液的体积 (一般每 10 川细胞用 100 川一 200 川 TAPBu 价 r)。
搁置于冰上 30min,每 10min 用移液枪吹打细胞一次使之充足悬浮。
在 4OC 下用 100009 高速离心 15min,把上清转移到新的试管中进行下一步实验 ,抛弃积淀。
2、13 细胞自噬活性的检测我们主要经过两条门路来引诱细胞发生自噬,一饥饿办理 ,二药物 RaPamycin 办理。
对于饥饿办理 ,吸去正常培育的细胞中的培育液,用 PBS 当心清洗细胞三次,注意不要使细胞离开培育皿 ,加入 15mlEBss( 用量依据培育皿的大小而定)连同 2 林 M 的 ED64 与 pePstatin。
在 37“C培育箱中培育 2 一 4h。
关于 RaPamycin 办理 ,在一般细胞培育液中加入终浓度为500nM 的 R 叩 amyein(sigma)37“e下培育12h。
细胞自噬活性的检测主要有两条门路,一条就是经过转染GFP 一 LC3, 再用荧光显微镜察看LC3在细胞质中的齐集。
二就是用westemblotting 与 LC3 的抗体 ,检测细胞内源LC3n 的增添。
关于荧光显微镜剖析,在U20S 细胞中转染 GFP 一 LC3,24h 以后 ,把细胞继代培育在有盖玻片的 6 孔板中 ,引诱自噬 ,吸去培育液 ,用 PBS 当心润洗玻片 1 次,在每个孔内加入 3% 的多聚甲醛 ,在室温下闭光摇摆培育玻片 20min 。
用 PBS清洗玻片3 次,每次每孔加2mlPBS 在室温下摇摆10min,用固定液把盖玻片固定在载玻片上 ,在室温下干燥 1min 以后用荧光显微镜察看。
电镜检测自噬方法
胰酶消化，收集药物作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%戊二醛和0.1%四氧化锇的PBS溶液中保存在4℃中过夜。
再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。
随后超薄切片用铜网固定，最后用重金属醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。
通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。
贴壁细胞：先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮（会产生碎屑）刮下；带培养液进行离心，1000-1500r/min，5-10min。
离心完毕倒出培养液，管底的细胞团不要打散，沿管壁倒入适量（一般为材料体积的5-10倍）的2.5-3.5%戊二醛固定液，固定约1h-2h，也可在4℃冰箱过夜。