专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价

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二、亚慢性毒性试验
确定外来化学物质在动物1/10左右的生命时间 内，反复多次接触后有无引起损害的观测过程。 又称短期试验、亚急性毒性试验（Subchronic toxicity test）。 目的：1.毒性确定 2.靶器官 3.慢性毒性试验依据
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试验方法
1.动物 一般选用大鼠(100～200g)或小鼠(15～20g)。 有条件时，采用供试药物的靶动物鸡等。外购 动物需饲养一周后才能供试验用。
0
2 5 7 10 ∑ ri24
0
0.2 0.5 0.7 1.0 ∑ Pi2.4
1
0.8 0.5 0.3 0 ∑ q2.6
6
-
-
-
计算LD50，代入下列公式： lgLD50=Xk - d（∑ Pi – 0.5) LD50 =Lg –1 [Xk - d（∑ Pi – 0.5)] 式中Xk 为最大对数剂量, ∑ Pi为死亡率的总和; d为相邻两组剂量比值的对数, d=lg1.2=0.0792
鼠分别给予供试品溶液0.5ml。 静脉注射：尾静脉注入供试品溶液，注射时 间一般为4～5秒，规定缓慢注射的药品可延 长至30秒。 皮下注射：可见注射部位皮下出现泡状隆起。
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（四）结果判定
除另有规定外，5只小鼠在给药后48小时
内不得死亡。如有死亡，另取体重17～20g
小鼠10只复测，全部小鼠在48小时内不得
3 . 试验方法 （1）动物 两种动物（啮齿类和非啮齿类），目前要求 用一种啮齿类动物进行全面系统的试验。
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（2）剂量分组
试验组：4～5个，设高剂量组1～2个，中剂量组1～2 个，低剂量组1～2个。 以LD50 的1/10、1/50、1/100、1/1000剂量分组。
对照组：1个
（3）染毒方式
混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。
试验数据
病理变化 写出评价报告
方差分析或X2
照片
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三、长期毒性试验
1.概念
外来化学物质在动物生命期的大部分时间或 终生接触于机体时所引起的损害作用，称为长期 毒性作用或慢性毒性作用。 确定外来化学物质这种慢性毒性作用的动物
试验观察方法，称为长期毒性试验。
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2.目的
观测长期反复摄入低剂量的受试物，可能对 机体造成的损害、严重程度、停药后的发展和恢 复情况，为临床试验提供依据。
体内:（3）微核试验(必做)
（4）精子畸形试验 （6）显性致死试验 必做（6） 选做 选做 若（4）、（5）任一项为阳性， （5）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验
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致畸:
（1）传统致畸试验(必做) （2）喂养繁殖毒性试验 （3）喂养致畸试验 （2）、（3）饲料药物添加剂必须增做 一般兽药必做
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一、艾母氏(Ames)试验方法
5.镜检
计数： 1000 个嗜多染红细胞（PCE）/片 求出：嗜多染红细胞/正染红细胞（NCE）
必要时，丫啶橙染色，荧光显微镜分析计数。
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6.结果评价
将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及 PCE/NCE之比。所得结果用t检验进行数据分析，经重复 试验P<0.01并有剂量反应关系时，判为阳性。
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S9制备
选体重200 g 左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱 导后宰杀（处死前12小时禁食）。在低温条件下， 无菌操作取出肝脏，用KCI液淋洗后置匀浆器中 制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或
–80℃ 冰箱。
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7.试验步骤
TA97a
增菌培养液
TA98
增菌培养液
TA100
增菌培养液
TA102
增菌培养液
5
小鼠腹腔注射敌百虫LD50计算表
组别 剂量 (mg/ kg) 对数剂量 (Xi) 实验动 物数(ni) 死亡动物 数(ri) 死亡率 (pi) 存活率(q)
1
2 3 4 5 合计
300
360 432 518 622
2.4771
2.5563 2.6355 2.7143 2.7938
10
10 10 10 10
有死亡，否则，判为不合格。
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第三节 制剂的安全性评价
一、热原反应试验 二、溶血性检查 三、局部刺激性试验 1. 家兔点眼法 2. 家兔股四头肌法 四、过敏性试验 五、降压物质检查
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一、热原反应试验
1.概念 是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物,主要 是细菌的一种内毒素。 大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵 母菌也能产生热原。 热原随注射液进入动物体后，轻则能引起体温 升高，严重的虚脱死亡。
37 ℃水浴 振荡培养
活菌数不得少于1～2 x 109/ml
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试验步骤
受检物 + 菌液 + S9混合液 或磷酸盐缓
（0.5ml） （0.1-0.2ml） （0.1ml）
无菌小试管 加入45 ℃顶层 培养基2ml 混匀
37 ℃水浴 振荡培养20imns
含底层 培养基 的平皿
37 ℃培养48h
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8.结果wenku.baidu.com价
1.原理
组氨酸缺陷型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨 酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培
养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成
组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长， 根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。
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组氨酸缺陷型（即突变型） 鼠伤寒沙门氏菌
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4. 溶剂 5. 对照物
水 每次检测均需要
阳性对照：已知的阳性药物 阴性对照：溶剂 加S9混合液时要同时作不加S9混合液的对照平皿
6. S9混合液
如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有 致突变作用，则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳 动物的肝微粒体（S9混合液），使受试物被活化而呈现 致突变作用。
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图示
原理：
诱变物 嗜多染红细胞
微核直径相当于红细胞直径的1/20～1/5。
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1.动物
成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。 10只/组，雌雄各半。
2.受试物的处理
将受试物溶于适宜的溶剂中,以0.1-0.2ml/10g体重的给 药体积配制成适当的浓度。 3.给药方式 给药途径：与临床用药途径相同。内服时需灌胃。
适当溶剂清除残留供试药。大鼠可采用浸尾方法给药。
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4.剂量与分组 正式试验前，用少量动物做预备试验，根据24 小时内动物死亡情况，估计LD50的可能范围，以 确定正式试验的剂量。一般分为4个剂量组，组间 剂量呈等比级数。其比值为：1:1.5-3.0。若用赋 形剂，需设赋形剂对照组。
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5.观察指标
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2.试验周期
临床用药期（天） 毒性试验给药期（天） 1～3 7 30 30天以上 14 28 90 6个月
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3.给药方式
试验周期 给药途径
14天
28天以上
大鼠、小鼠 灌胃 鸡 药丸 混饲 自由采食 饮水不限
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4.剂量与分组
大鼠
对照组
20只/组，雌雄各半
低剂量组
中剂量组
高于有效量，不出现毒性反应
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3.给药方式与最大体积 灌胃法: 一次最大灌胃量 腹腔注射: 一次最大注射量
1.0ml/只(小鼠) 4.0ml/只(大鼠) 1.0ml/只(小鼠) 3.0ml/只(大鼠)
4.剂量与分组 预试验 全部致死的最小剂量LD100和全部存 活的最大剂量LD0 正式试验 5-7个剂量组,组间剂量呈等比级数, 其比值为1.2-1.4.
高剂量组
部分动物出现毒性反应或死亡
但死亡数不超过20%
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5.观察指标
分六大项，具体指标为： （1）健康状况 每天 （2）体重，饲料消耗 2-3次/周 （3）血液学检查 定期 （4）血液生化学检查 定期 （5）肝、肾绝对重量和脏器指数 试验结束时 （6）剖检、组织病理学检查 试验结束时
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6.结果处理
供试药物如是固体，应磨成细粉状，过120目筛，并用
适量水或无毒无刺激性赋型剂（橄榄油、羊毛脂、凡士
林等）混匀。如为液体，一般不要稀释。
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3.给药方式
脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛 后24小时检查皮肤，如无损伤才能进行试验。将供试药 物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的10%， 用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防 脱落和动物舔食。敷药24小时。试验结束后，用温水或
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三、异常毒性检查
（一）目的 将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内
或口服给药，在规定时间内观察小鼠的死 亡情况，以判定供试品是否符合规定的一 种方法。
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（二） 实验动物 小鼠 健康无伤， 体重17～20g。 做过本实验的小鼠不能重复使用。
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（三）检验方法
取5只小鼠，按药物的给药途径，每只小
则: LD50 = Lg –1 [2.7938-0.0792(2.4-0.5)]= Lg –1 2.6433
=439.87(mg/kg)
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经皮给药的急性毒性试验
1.动物
选用健康家兔（2.0～3.0 kg）、豚鼠(350～450 g)或 大鼠(200～300 g)，每组动物不少于6只，雌雄各半。
2.供试药物的配制
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5.观察指标
动物一般健康状况，中毒表现和死亡过程。 时间：7天。 死亡动物：大体剖检、病理组织学检查（必要时）
6.LD50计算
寇氏法 计算供试药的LD50值及其95%可信限范围。
7.结果判定
大鼠一次经口LD50在1 mg/kg以下为极毒，1～50 mg/kg为剧毒，50 ～ 500 mg/kg为中等毒，500 ～ 5000 mg/kg为低毒，5000 mg/kg以上者为实际无毒。
受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂 量反应关系和重现性，判为诱变阳性。
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二、微核试验
原理： 骨髓细胞染色体经诱变物作用，发生突变后出 现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极， 在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而存留 于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构， 并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小， 故称微核（micronucleus）。
专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价
一般毒性试验:
急性毒性试验 亚慢性毒性试验
长期毒性试验
特殊毒性试验:
“三致”试验 致畸、致突变、致癌
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第一节 一般毒性试验
一、急性毒性试验
(1)经口或注射给药的急性毒性试验 (2)经皮给药的急性毒性试验 目的： （1）求出受试物的半数致死量（LD50）。 （2）阐明受试物急性毒性的剂量-反应关系与中毒特征，为急
给药剂量：以LD50为依据，设三个剂量组。
高剂量组 LD50的0.8-0.5 ； 低剂量组 LD50的0.05-0.1 并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的
能诱发微核阳性的诱变剂。
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4.试验操作
一次给药：24，48，72小时取样制片。 二次给药：第二次给药后的6，24小时取样制片。 处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。 姬姆萨染色，镜检。
观察动物的全身中毒表现和死亡情况，观察 时间为一周。若给药4天后仍有动物死亡时，仍 需继续观察一周，对死亡动物应做大体剖检，必 要时进行病理组织学检查。
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6 . 结果判定
兔涂皮LD50在5 mg/kg以下为极毒，5～44 mg/kg为剧毒，44 ～ 350 mg/kg为中等毒， 350 ～ 2180 mg/kg为低毒，2180mg/kg以上者为 实际无毒。
缺乏组氨 酸的培养基
加有致突变原 的培养基
野生型（能合成组氨酸）
。。。。 。。。
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2.菌种 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、
TA100、TA102 四个标准株。
3.剂量分组 每次试验要求4--5个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。 高剂量以不抑菌为原则。 液态受试物：0.05-50 ul/平皿 固态受试物：0.1-1000 ug/平皿，最高剂量可达5000 ug/平 皿。 选定后剂量的药物应配制成适当浓度 体积：100ul或200 ul/皿。
救治疗措施提供依据。
（3）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提 供依据。
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经口或注射给药的急性毒性试验
1.动物 小鼠（体重18～22g）、大鼠（体重180～200g） 或其他敏感动物。应注明动物的品系。每组小鼠不 少于10只、大鼠不少于6只，雌雄各半，雌性应未 产无孕。 2.供试药物的配制 一般用水为溶剂,将药物配成一定浓度的溶液.
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（4）观察指标
一般情况：健康、生长发育、进食量，特别是体重。 生物化学指标：肝、肾功能。 血液学变化：Hb，WBC，RBC， 病理学检查 ： 病理解剖和病理组织学变化。 （5） 结果评价 参考亚急性毒性试验。
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第二节 特殊毒性试验
致突变:
体外:（1）艾母氏(Ames)试验(必做) （2）哺乳动物培养细胞染色体畸变（CHO、CHL）选做