生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验讲义
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
分子生物学实验技术原理
分子生物学实验技术原理嘿，朋友们，今天咱们来聊聊那些让人头大的分子生物学实验技术原理。
你知道的，那些在实验室里，穿着白大褂，戴着护目镜的科学家们，他们每天都在捣鼓些什么呢？别急，让我给你细细道来。
首先，咱们得从DNA说起。
DNA，也就是脱氧核糖核酸，是所有生物体内存储遗传信息的分子。
它长得像一个螺旋梯子，由两条长长的链组成，链上的“梯级”就是那些我们常听到的碱基对：腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。
这些碱基对按照特定的规则配对，A总是和T配对，C总是和G配对。
那么，分子生物学家们是怎么研究这些DNA的呢？他们用到了一种叫做PCR （聚合酶链反应）的技术。
PCR就像是一个复制机器，能够在短时间内复制出成千上万份DNA。
想象一下，你有一个DNA样本，你想要更多的副本来做实验，PCR就能帮你实现这个愿望。
这个过程需要一个叫做“热循环仪”的设备，它能够精确控制温度，让DNA在高温下解开成两条单链，然后在低温下让特定的引物（一小段DNA）找到它们的目标位置，最后在适宜的温度下让DNA聚合酶把新的DNA链合成出来。
接下来，咱们聊聊基因克隆。
基因克隆，听起来是不是很高大上？其实，它就是把一个特定的基因从一大堆DNA中“挑”出来，然后复制很多份。
这就像是在一本厚厚的书里找到你最喜欢的那一页，然后复印很多份。
科学家们用到了一种叫做“限制性内切酶”的工具，这种酶能够识别特定的DNA序列，并在那个位置把DNA切断。
然后，他们用DNA连接酶把目标基因和载体（一种能够自我复制的DNA分子）连接起来，这样就能在细菌或者酵母中大量复制这个基因了。
哦，对了，还有测序。
测序就是确定DNA序列的过程，就像是读出DNA的“字母表”。
最早的测序技术叫做Sanger测序，它需要放射性同位素或者荧光标记的核苷酸。
现在，我们有了更先进的技术，比如下一代测序（NGS），它能够同时测序成千上万个DNA片段，大大提高了效率。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验是研究生命分子结构和功能的基础。
分子生物学的研究对象是生命体内的DNA、RNA、蛋白质等生物分子，通过实验可深入了解生命分子的结构及其功能，为治疗疾病等产生重要的科研意义。
本文将着重介绍PCR扩增、基因克隆、蛋白质表达和酶联免疫吸附实验等分子生物学实验。
PCR扩增PCR扩增是分子生物学领域中使用最广泛的实验技术之一。
PCR扩增技术是通过不断的复制，使DNA分子增多。
PCR主要操作步骤包括：DNA样品提取、模板DNA扩增、DNA回收纯化和定量检测等。
PCR扩增实验分为两部分：第一部分是制备PCR反应混合物，包括模板DNA、引物（Primer）、反应缓冲液、酶、脱离剂、种子液等。
制备反应混合物的过程中，需要将所有的试剂按照一定比例混合后，将混合液均匀吸入PCR管内。
第二部分是PCR反应实验本身，包括控制PCR反应温度变化、确保每个PCR 反应的时间和温度一致、等等。
PCR反应时间通常在2-6小时之间，取决于所扩增的DNA片段的长度和针对不同目标所使用的引物。
基因克隆基因克隆是利用重组DNA技术将外源DNA和载体DNA组装重组成新的DNA分子，然后通过转化等方式将新的DNA分子转移到感受态宿主细胞中，使得新的DNA分子被细胞所接受并复制，从而达到克隆目的的一种实验方法。
基因克隆实验的主要操作步骤包括：选取适当的载体，将所需要的外源DNA和载体DNA连接起来组成重组DNA分子，将重组DNA分子转化至感受态宿主细胞中，最后从发酵液中提取所需的目标DNA分子。
基因克隆技术在分子生物学实验研究中起到了重要的作用，使得我们能够制备大量目标分子用于进一步的研究。
蛋白质表达蛋白质表达是一种将蛋白质合成出来的实验技术。
蛋白质表达技术的主要目的是利用外源基因的扩增技术，将目标蛋白表达并纯化出来，从而进一步深入了解蛋白质的结构及其功能。
蛋白质表达实验的主要操作步骤是：蛋白质的基因落库、基因克隆到重组基因载体中、启动子、子纯化表达及活性鉴定等。
分子实验室常用ELISA原理和方法
ELISA检测原理及方法ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
一、原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
检测的对象可以是抗原也可以是抗体。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体（聚苯乙烯微量滴定板）的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
二、检测类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，本检测方法有三个必要试剂：1）与固相载体结合的抗原或抗体，又称免疫吸附剂；2）酶标抗原或抗体，又称结合物；3）酶反应底物，又称显色剂在实际应用中，通过不同的设计，具体的检测方法可有多种：1）间接法；2）双抗体夹心法；3）竞争法；4）双位点一步法；5）捕获法测IgM抗体；6）应用亲和素和生物素的ELISA测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。
这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。
其方法简单，方便迅速，特异性强。
三、操作步骤方法1用于检测未知抗体的间接法（要求抗原纯度高，提高实验特异性）：1)包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10 μg/ml，100 μl/孔，4℃包被过夜过夜；2)洗涤：1*PBST洗涤，3-5次，拍甩干净；3)封闭：5%脱脂奶粉/猪血清封闭液，37℃，封闭2-3 H;4)洗涤：1*PBST洗涤，3-5次，拍甩干净；5)待检样品：酶稀液倍比稀释待检样品，100 μl/孔，37℃孵育1H（同时做空白、阴性及阳性孔对照）；6)洗涤：1*PBST洗涤，3-5次，拍甩干净；7)二抗：加入酶标二抗1/2000-1/4000，100μl/孔，37℃孵育30-45min;8)洗涤：1*PBST洗涤，3-5次，拍甩干净；9)显色：加显色液，100 μl/孔，8-10min；10)终止：2M硫酸终止，50 μl/孔；11)读数：酶标仪读取在OD450nm处的吸收值12)数据分析：阳性判定值≥2.1*阴性值。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验1.基因克隆实验：基因克隆实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的DNA序列克隆到重组DNA分子中。
这个实验通常包括DNA的摘取、PCR扩增、限制性内切酶的消化、连接载体、转化大肠杆菌等步骤。
2. 蛋白质表达实验：蛋白质表达实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质表达到大肠杆菌等宿主细胞中。
这个实验通常包括将感兴趣的基因克隆到表达载体中，表达载体转化至宿主细胞，利用诱导剂等物质诱导表达蛋白质等步骤。
3. PCR实验：PCR实验是一种基于酶催化反应的分子生物学实验。
该实验通过模板DNA、引物、酶及核苷酸等原料，经一系列温度变化，扩增目标DNA片段。
该实验通常用于基因克隆、DNA测序、点突变检测等领域。
4. DNA测序实验：DNA测序实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是确定DNA序列。
这个实验通常包括PCR扩增、DNA纯化、测序反应、数据分析等步骤。
5. RNA干扰实验：RNA干扰实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用RNA干扰技术抑制特定基因的表达。
这个实验通常包括制备siRNA、合成siRNA、转染细胞等步骤。
6. 蛋白质纯化实验：蛋白质纯化实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是将感兴趣的蛋白质从混合物中提纯出来。
这个实验通常包括细胞裂解、纯化、检测等步骤。
7. 荧光检测实验：荧光检测实验是一种常见的分子生物学实验，其目的是利用荧光分子标记分子或细胞等，观察其分布、表达及功能等。
这个实验通常包括荧光染色、荧光显微镜观察等步骤。
8. 基因编辑实验：基因编辑实验是一种新兴的分子生物学实验，其目的是通过基因编辑技术，直接改变DNA序列，从而实现对基因的修饰。
这个实验通常包括CRISPR/Cas9等基因编辑技术的设计、实现、检测等步骤。
冷沉淀法在分子生物学实验中的常用技巧总结
03
报告撰写
按照规范的格式撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等部
分，并附上相应的图表和数据支持。同时，注意报告的语言要准确、简
洁、清晰，避免使用模糊或不确定的表述。
05
常见问题解答与误区提示
操作过程中可能遇到的问题及解决方案
问题1
解决方案
问题2
解决方案
冷沉淀法实验中出现沉淀不完 全或沉淀物不纯净。
误区1
将非特异性沉淀误认为是目标蛋白质。
提示
在结果解读时，要注意区分特异性沉淀和 非特异性沉淀，可以通过对照实验、改变 实验条件等方法进行验证。
误区2
忽视沉淀物中可能存在的杂质成分。
提示
在对沉淀物进行分析时，要注意检查其中是 否含有其他杂质成分，如核酸、多糖等，这 些成分可能会影响后续实验的结果。
经验分享：如何提高实验效率和准确性
采用低温保存方法。
03
冷沉淀法操作步骤详解
样品加入和混合均匀技巧
样品加入
将待处理的样品缓慢加入到冷沉淀剂 中，避免产生大量气泡和局部浓度过 高。
混合均匀
使用适当的搅拌器或振荡器将样品与 冷沉淀剂充分混合均匀，确保反应体 系温度均匀且沉淀效果一致。
温度控制和时间把握策略
温度控制
冷沉淀法需要在低温下进行，通常控制在4°C左右。可使用冰水浴或低温恒温 器来维持反应体系温度稳定。
蛋白质纯化
利用不同蛋白质在低温下的溶解度差 异，通过冷沉淀法可实现目标蛋白质 的分离和纯化。
原理简述与操作流程
原理
冷沉淀法基于溶质在溶剂中的溶解度随温度变化而变化的原 理。在低温条件下，某些溶质的溶解度降低，从而以沉淀形 式析出。
操作流程
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
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分子生物学实验技术使用指南
分子生物学实验技术使用指南背景随着生物科技的飞速发展，分子生物学实验技术变得日益重要。
无论是基础研究还是应用研究，分子生物学实验技术都扮演着关键角色。
本文将深入探讨几种常用的分子生物学实验技术，并提供使用指南。
1. DNA提取技术DNA提取是分子生物学实验中的第一步。
合理高效的DNA提取可以确保后续实验的顺利进行。
常用的DNA提取方法包括Phenol/Chloroform法、Qiagen柱法等。
对于不同的样品类型，选择合适的方法非常关键。
例如，对于植物样品，除了常规提取方法外，还可以使用植物基因组DNA提取试剂盒进行快速提取。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学实验中的常用技术。
它使得我们能够在实验室中迅速扩增DNA片段。
在PCR过程中，引物的设计非常重要。
合理严谨的引物设计能够提高扩增效率，并避免非特异扩增。
此外，选择适当的扩增条件和酶的浓度也是成功PCR实验的关键。
3. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化可以用于DNA片段的切割和鉴定。
合理选择适合的限制酶是至关重要的。
在消化反应中，反应的时间和温度是需要特别注意的因素。
此外，对于限制性内切酶的消化产物的鉴定，可以使用琼脂糖凝胶电泳或PCR扩增来进行。
4. 基因克隆技术基因克隆是分子生物学实验中常用的技术手段。
在基因克隆过程中，选择合适的酶切位点和载体是至关重要的。
克隆之前，需要仔细设计引物以扩增目标基因。
成功克隆后，还需要验证所克隆基因的准确性。
这可以通过测序和进一步的功能检测来完成。
5. 蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术是研究蛋白质表达和相互作用的重要技术。
在进行免疫印迹实验前，需要制备合适的细胞裂解液来提取蛋白质。
之后，需要将蛋白质样品进行分离，并转移到膜上。
此外，合适的抗体选择和浓度优化也对实验结果有重要影响。
6. 基因组测序技术基因组测序是分子生物学研究中不可或缺的技术。
高通量测序技术的发展使得基因组测序变得更加快速和准确。
生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA 和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
生物化学与分子生物学实验
生物学实验B实验一不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。
[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉（微波炉）二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
（由于所需药品为为神经毒性物质，注意不要经口鼻吸入，皮肤不要碰到药品，所以称量时，请戴上口罩，带好手套）2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
常用分子生物学和细胞生物学实验技能技术总结介绍
精心整理常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍(2011-04-2311:01:29)转载▼标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe ）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA 和细胞总RNA 的已知 固相杂交Southern DNA 片段Northern 复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
cDNA 微点隈杂交（cDNAmicroarrayhybridization ）是指将cDNA 克隆或cDNA 的PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA 探针与微点阵上的DNA 进行杂交。
再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。
它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。
已成商品问世。
其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。
寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotidemicroarrayhybridization ）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt 的混合RNA 或cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。
应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。
适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。
分子生物学实验
实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析【实验目的】通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【实验原理】CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。
利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。
然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。
把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。
凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
1 OD260相当于dsDNA 50 μg/m l，ssDNA 33 μg/m l和ssRNA 40 μg/m l。
可以此来计算核酸样品的浓度。
紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
PCR技术的类型原理及应用
PCR技术的类型原理及应用什么是PCR技术？聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在分子生物学实验室中常用的技术，可以在体外扩增DNA片段。
PCR技术的出现为基因检测、基因工程和分子生物学等领域提供了极大的便利。
PCR技术的基本原理是将一段DNA模板序列在体外通过一系列的温度循环中，利用热稳定的DNA聚合酶（如Taq聚合酶），进行大规模扩增。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，它通过热循环，迅速复制和扩增DNA。
PCR技术的类型PCR技术主要有以下几种类型：1.常规PCR：常规PCR是最常用的PCR技术类型，也被称为标准PCR或常规聚合酶链反应，它在一定程度上限制了DNA扩增的长度。
常规PCR通常适用于生成较小的DNA片段，Typically, 优化后的反应条件是将样本DNA与引物，缓冲液和聚合酶加入于反应管中，反应管放入PCR仪中进行温度循环，使DNA扩增。
2.逆转录PCR：逆转录PCR是一种将RNA转录成DNA进行扩增的技术。
该技术首先将RNA逆转录成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增。
逆转录PCR在研究基因表达、研究RNA病毒等方面具有重要的应用价值。
3.实时定量PCR：实时定量PCR是PCR技术的进一步发展，它可以即时监测PCR反应过程中的DNA扩增量。
实时定量PCR通常根据荧光信号的增加来监测反应的进程，可以实时定量和分析样本中的DNA含量。
该技术广泛应用于基因表达分析、疾病诊断等领域。
4.数字PCR：数字PCR是一种精确测量DNA的技术，可以绝对定量DNA的拷贝数。
和实时定量PCR相比，数字PCR可以更准确地测量目标DNA的拷贝数，但适用范围相对较窄。
5.多重引物PCR：多重引物PCR（Multiplex PCR）是一种同时扩增多个目标序列的技术。
在一个PCR反应体系中，通过引入多个不同的引物和多个目标DNA，可以同时扩增多个目标序列。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (3)实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 (5)实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (6)实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (8)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (9)实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (10)实验八RNA提取与纯化 (12)实验九RT-PCR扩增目的基因cDNA (15)实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 (17)实验十一感受态细胞的制备及转化 (18)实验十二克隆的筛选和快速鉴定 (20)实验十三DNA分析——Southern杂交 (22)一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学是现代生物学的重要分支之一，其在疾病预防、治疗和生物科技等方面有广泛应用。
本文将介绍分子生物学实验中常用的技术，并讨论其原理和应用。
一、基本实验技术1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学实验中的基础技术之一。
DNA/RNA提取的目的是从细胞或组织中提取高质量的DNA或RNA，为其后续检测和研究做好准备。
现在市场上有多种DNA/RNA提取试剂盒，供实验室使用。
通常，提取DNA首先将组织/细胞裂解，然后进行蛋白质沉淀、DNA沉淀、洗涤和重溶等步骤。
而提取RNA则需要防止RNA酶的污染并保护RNA的完整性。
RNA提取常见的方法是直接裂解和三步酚-氯仿法等。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR反应是在一个热循环下进行的，包括退火、结合和扩增阶段。
其中，退火温度用于将引物与靶DNA结合，获得高特异性；扩增阶段用于扩增目标DNA片段，通常在72℃左右进行。
PCR技术广泛应用于疾病的诊断、基因多态性分析、DNA指纹鉴定和基因工程等方面。
对于基因工程，PCR技术在基因克隆、定量PCR、mutagenesis、突变扫描和芯片检测等方面也有重要应用。
3. 转染技术转染技术是指将外源基因或其他化合物转入目标细胞中的技术。
常用的转染方法包括：病毒介导的转染、电穿孔、化学转染及基于脂质体的转染等。
转染技术在基因治疗、模型建立、基因表达分析、药物筛选和基因敲除等方面都有广泛应用。
二、高级实验技术1. 基因测序技术基因测序是分子生物学中应用最广泛的技术之一，用于确定DNA序列。
常用的基因测序技术包括Sanger测序和新一代测序（NGS）技术。
Sanger测序是一种传统的测序技术，通过DNA聚合酶、DNA模板、引物和ddNTPs（二脱氧核苷三磷酸）来扩增和定序DNA。
此外，NGS技术的基本原理是平行测序，利用高通量测序技术对DNA样本进行重复测序，得到高质量的DNA序列。
分子生物技术—PCR技术
PCR的反 应体系
脱氧核苷三磷酸 C
D
（dNTP）
即dNTP为dATP、dCTP、 dGTP和dTTP四种脱氧 核苷三磷酸的混合物
E
镁离子浓度
可稳定核苷酸和提高
Taq DNA聚合酶的活性,
MgCl2浓度一般为 1.5mmol/L为宜
Taq DNA聚合酶
催化DNA合成，即在模 板指导下，以dNTP为
二、PCR技术基本原理
PCR是在试管中进行的DNA复制 反应，基本原理与细胞内DNA的 复制基本相似。每一次循环复制包 括3个步骤：
• 变性 • 退火 • 延伸
二、PCR技术基本原理
变性（denature） • 通过加热至95℃左右，使DNA
双螺旋的氢键断裂，形成DNA 单链模板而游离于反应体系中， 此过程称为变性
二、PCR技术基本原理
退火（annealing） • 即在较低的温度(40～70℃)下使
加入的引物与待扩增的DNA区域 特异性结合，以提供DNA复制起 始的3’-OH端
二、PCR技术基本原理
延伸（extension）
• 即在适当的温度下（70℃～75℃ ），DNA聚合酶特异性结合到 DNA模板上的引物的3’-OH端 ，以dNTP为反应原料，以靶序列 为模板，根据碱基互补配对原则 ，进行DNA链的延伸，即合成 DNA新链
原料，使DNA链沿 5′→3′方向延伸
三、PCR反应技术在临床的应用
• 人类遗传疾病的诊断与研究，如地中海 贫血、血友病、苯丙酮尿症等致病基因 的检测
• 病原体的检测，包括细菌、病毒、支原 体、衣原体以及原虫等的检测，用于传 染病的诊断、变异株分析、流行病学研 究
• 肿瘤检测，如检测白血病、淋巴瘤、消 化道肿瘤等细胞基因的改变
分子生物学实验技术
分子生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学是生物学的一项重要分支，它研究细胞分子机制、基因调控、遗传信息的传递、处理和表达等。
分子生物学实验技术是对分子生物学研究进行实验室操作和检测的方法与技术。
本文将从基础实验技术、基因克隆技术、基因表达技术、基因分析技术四个方面深入介绍分子生物学实验技术的相关内容。
一、基础实验技术在分子生物学研究中，藏龙卧虎的实验技术为实验的准确性和精细度提供了保障。
以下是分子生物学实验室常用技术的简介：1、聚合酶链式反应PCR技术是分子生物学重要的实验技术，通过PCR技术，能够将极少量的DNA 扩增为大量的DNA。
PCR在分子生物学中有广泛应用，包括基因片段的克隆、置换突变、基因型检测、DNA 测序等诸多方面。
PCR反应需要引物和DNA模板，引物和模板配合的合理性是PCR反应的关键。
PCR反应具体操作时需要根据引物的长度、Tm值、模板浓度、扩增片段长度等因素，进行优化以达到最佳扩增效果。
2、蛋白质电泳蛋白质电泳是一种分离蛋白质的技术，可按照分子质量和电荷分离其中的成分。
蛋白质电泳具体操作时比较复杂，核心是电泳样品的制备和电泳条件的设置。
电泳样品的制备主要包括电泳缓冲液的配制、蛋白质提取、样品准备、蛋白质定量和蛋白质加样。
电泳条件的设置主要包括电泳槽的填充、初始电压、电泳时间、gel浓度等。
3、核酸电泳核酸电泳是一种分离核酸的技术，通过电泳将带负电的DNA/RNA片段从电泳起点移向电极终点，达到分离纯化的目的。
关键是电泳实验条件的设置，包括电泳缓冲液的配制、电泳时间、电压、电泳gel浓度和transfer buffer浓度等。
4、原位杂交法原位杂交法是研究DNA 和RNA 相互作用的一种方法。
该方法能够定量测定DNA或RNA与特定基因的结合能力，从而实现特定基因的检测与鉴定。
原位杂交方法的操作步骤主要包括制备标记探针、制备样品、加标记探针、定性分析、定量分析等。
此方法具有灵敏度高，特异性强等优点。
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生物分子类实验室常用实验技术原理汇总………………一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA 序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。
基因芯片主要用于基因检测工作。
基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。
当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
据此可重组出靶核酸的序列。
五、高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。
当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。
六、酵母双杂交（Y2H）七、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。
所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
八、RNA提取（Trizol法）Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA 和蛋白质。
九、RT-PCRRT-PCR 是将RNA 的反转录（RT ）和cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR ）相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA 合成 cDNA ，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。
RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。
在两步法RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。
实验步骤：1、RNA 的提取；2、反转录合成cDNA；3、PCR扩增；4、产物的电泳和结果的测定。
十、实时荧光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR ）利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期。
C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数。
十一、BCA法测蛋白质浓度十二、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备1、前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2、取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3、将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；6、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7 、4℃下3000 g冷冻离心5分钟；8 、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9 、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
十三、碱变性提取质粒DNA碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选（1）总过程：分---PCR分离目的基因切---限制性内切酶切割接---目的基因与载体相连转---转入宿主细胞筛---筛选阳性重组体（2）分---PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选（3）切---限制性内切酶切割：粘性末端、平末端（4）接---目的基因与载体相连原理：利用DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性和利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接。
（5）转---转入宿主细胞感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。
（6）筛---筛选阳性重组体十五、RNA干扰（RNAi）一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。
十六、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
十七、基因文库和cDNA文库的构建（看课本上的）十八、mRNA差异显示技术（DD-PCR）mRNA差异显示技术是将mRN A逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。
每一种细胞（包括同一组织细胞经过不同的处理）都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱（有差异基因表达），即特异的RNA指纹图谱。
差异基因表达是细胞分化的基础，正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和凋亡等。
mRNA DDR T－PCR 技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
其基本原理是从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中提取总RNA，逆转录成cDNA ，用不同引物对，进行PCR 扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。
利用测序胶电泳技术分离PCR 产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。
十九、抑制差减杂交抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。
其依据的主要技术有两点:(1)消减杂交;(2)抑制PCR。
经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。