中药含量测定方法
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HPLC是一种“软”的分析方法—没有标准 图谱可供比对
HPLC是紧密依赖“标准物质”而松散依赖 “标准方法”的方法
HPLC是定量分析的巨人，定性分析的“侏 儒”
高分离度 高速度 高灵敏度 高容量 高灵活性
HPLC的特点
高效率
作为检测手段 作为制备手段 分离方式众多
应用范围广
极性大 沸点高
HPLC的应用对象
溶解 尺寸排阻 亲和
手性
M
S1,2 S1 S2
S1 S2
S
色谱的基本方程
分配系数 K = [A]s / [A]m 容量因子 k’ = Ms / Mm
K = k’(Vm / Vs)
当一个给定溶质的最大值刚刚到达柱子末端时， 已有一半的溶质洗脱在一定的体积中(VR)中，其余一 半溶质仍然留在柱子中。
由于一般色谱现象的存在，峰宽随着保留时间的 延长而增加。峰相距再远，峰太宽，仍然不能分离。
良好的分离应该是：峰之间有一定的距离，峰形 尽量窄。
分离度 Rs = 2 (tR2-tR1) / (W2+W1)
1）点样：条状，50~300ul 2）定位：对照的位置，区带的范围
紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描 3）捕集： 4）洗脱：
渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取 荧光板应洗脱后再比色 5）显色及比色 显色剂用量 反应时间、反应温度 显色稳定性 空白试剂及固定相最好不显色
2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱 性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧 化铝扩大使用范围）
3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适 用于酚类、醇类化合物的分离
4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适 用于分离亲水性物质
同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级
2、薄层色谱-可见分光光度法
有机化合物
难气化 热稳定性差 易电离 分子量大
通过衍生化反应转变为有机物 的无机物
采用特殊分离模式和检测手段 亦可分析阴阳离子
HPLC的应用范围
GC 20%
HPLC
ห้องสมุดไป่ตู้80%
GC
HPLC
第二部分 HPLC基础理论简介
1. 色谱的基本过程—差速移行 2. 色谱的基本方程— VR = VM (1+k’) 3. 色谱的重要理论—塔板理论和速率方程理论 4. 色谱分离的量度—a和Rs 5. HPLC高效的理论基础
Van Deemter 方程
色谱分离的量度—a和Rs
N或H仅作为色谱柱效率的量度，但不能衡量在 同一根色谱柱上两个物质分离的好坏。
分离系数 a = k2’/k1’ = tR2’/tR1’ = VR2’/VR1’ a代表了两个物质在相同的色谱条件下的分离选 择性。
a只是从热力学上表示两物质分离的可能性，直 观地看，仅表示两峰相差多远，没有考虑峰的宽度。
第六章
中药含量测定方法
一、薄层色谱法
1、概述
一）薄层色谱法的特点
广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高 薄层色谱法适于分析小量样品 可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展
开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化 学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换， 薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定， 难挥发的样品。
3、薄层色谱-紫外分光光度法
不需加显色剂 其他同薄层色谱-可见分光光度法
4、薄层色谱扫描法
扫描方式：
反射法：紫外光区 透射法：可见光区
波长选择方式：
单波长法 双波长法：消除背景干扰
注意事项
样品的前处理：溶剂提取 吸附剂的选择：散射系数 点样 光源的选择：钨灯、氘灯、汞灯、氙灯 展开剂的选择 显色剂的选择 双波长法扫描光束的选择：最大吸收和无吸收点
波长 扫描方式的选择：线性扫描、锯凿形扫描
5、薄层色谱-发光分析法
胶束增敏荧光法 -环糊精包含增敏作用 鲁米诺（Luminol)等化学发光体系
二、高效液相色谱
第一部分 HPLC概述
1. HPLC的基本描述 2. HPLC的几个重要概念 3. HPLC的特点 4. HPLC的应用对象
（二）方法原理 薄层色谱分离法是将
固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制 成薄层板，试样中的各组分在固定 相和作为展开剂的流动相之 间不断地发生溶解、吸附、再溶解、 再吸附的分配过程。不同物质上升 的距离不一样而形成相互分开的斑 点从而达到分离。
（三）固定相
（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸 性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱 性硅胶扩大使用范围）
HPLC的基本描述
在经典液相柱色谱法基础上发展起来的一种 色谱方法
液相柱色谱法原理和气相色谱理论相结合的 产物
当今色谱技术中极具活力、发展迅速的的分 离分析技术
技术难度较大、不宜熟练掌握、极具挑战性 的分离分析方法
HPLC的几个重要概念
HPLC是一种分离方法，有多种分离模式
HPLC是一个连续过程
色谱的基本过程
利用不同物质在两个相（流动相和固定相）之间 具有不同的平衡分配系数来进行分离；
物质的化学、物理、物理化学性质上的差异，反 映在与固定相和流动相之间作用力上也有所差异—— 色谱分离的基础。
不同的平衡分配系数来自于不同的作用力；作用 力的不同构成了多种分离模式：
吸附 离子交换 疏水作用 键合相
按质量平衡原理，VR[A]m = Vm[A]m + Vs[A]s 两边都除以[A]m， VR = Vm + Vs ([A]s / [A]m)
= Vm + KVs = Vm(1+k’) 流动相流速恒定， tR = to (1 + k’)
塔板理论
理论塔板数 N = 5.54 (tR / W1/2)2 N是反映物质在固定相和流动相中动力学特征的 重要参数，是代表一根色谱柱效能的指标。
N保持不变，tR ，W1/2 —— “一般色谱现象” 理论塔板高度 H = L / N —— 码书原理 H 的意义？ 实际上，色谱中并不存在塔板，是一种理论假设
速率方程理论
涡流扩散 传质阻力
纵向分子扩散
流动相中传质 固定相里流动相中传质 固定相中传质
理论塔板高度 H = 2ldp + CdDm/u + (Cm+Csm)dp2u/Dm + Csdf2u/Ds = A + B/u + Cu
HPLC是紧密依赖“标准物质”而松散依赖 “标准方法”的方法
HPLC是定量分析的巨人，定性分析的“侏 儒”
高分离度 高速度 高灵敏度 高容量 高灵活性
HPLC的特点
高效率
作为检测手段 作为制备手段 分离方式众多
应用范围广
极性大 沸点高
HPLC的应用对象
溶解 尺寸排阻 亲和
手性
M
S1,2 S1 S2
S1 S2
S
色谱的基本方程
分配系数 K = [A]s / [A]m 容量因子 k’ = Ms / Mm
K = k’(Vm / Vs)
当一个给定溶质的最大值刚刚到达柱子末端时， 已有一半的溶质洗脱在一定的体积中(VR)中，其余一 半溶质仍然留在柱子中。
由于一般色谱现象的存在，峰宽随着保留时间的 延长而增加。峰相距再远，峰太宽，仍然不能分离。
良好的分离应该是：峰之间有一定的距离，峰形 尽量窄。
分离度 Rs = 2 (tR2-tR1) / (W2+W1)
1）点样：条状，50~300ul 2）定位：对照的位置，区带的范围
紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描 3）捕集： 4）洗脱：
渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取 荧光板应洗脱后再比色 5）显色及比色 显色剂用量 反应时间、反应温度 显色稳定性 空白试剂及固定相最好不显色
2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱 性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧 化铝扩大使用范围）
3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适 用于酚类、醇类化合物的分离
4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适 用于分离亲水性物质
同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级
2、薄层色谱-可见分光光度法
有机化合物
难气化 热稳定性差 易电离 分子量大
通过衍生化反应转变为有机物 的无机物
采用特殊分离模式和检测手段 亦可分析阴阳离子
HPLC的应用范围
GC 20%
HPLC
ห้องสมุดไป่ตู้80%
GC
HPLC
第二部分 HPLC基础理论简介
1. 色谱的基本过程—差速移行 2. 色谱的基本方程— VR = VM (1+k’) 3. 色谱的重要理论—塔板理论和速率方程理论 4. 色谱分离的量度—a和Rs 5. HPLC高效的理论基础
Van Deemter 方程
色谱分离的量度—a和Rs
N或H仅作为色谱柱效率的量度，但不能衡量在 同一根色谱柱上两个物质分离的好坏。
分离系数 a = k2’/k1’ = tR2’/tR1’ = VR2’/VR1’ a代表了两个物质在相同的色谱条件下的分离选 择性。
a只是从热力学上表示两物质分离的可能性，直 观地看，仅表示两峰相差多远，没有考虑峰的宽度。
第六章
中药含量测定方法
一、薄层色谱法
1、概述
一）薄层色谱法的特点
广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高 薄层色谱法适于分析小量样品 可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展
开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化 学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换， 薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定， 难挥发的样品。
3、薄层色谱-紫外分光光度法
不需加显色剂 其他同薄层色谱-可见分光光度法
4、薄层色谱扫描法
扫描方式：
反射法：紫外光区 透射法：可见光区
波长选择方式：
单波长法 双波长法：消除背景干扰
注意事项
样品的前处理：溶剂提取 吸附剂的选择：散射系数 点样 光源的选择：钨灯、氘灯、汞灯、氙灯 展开剂的选择 显色剂的选择 双波长法扫描光束的选择：最大吸收和无吸收点
波长 扫描方式的选择：线性扫描、锯凿形扫描
5、薄层色谱-发光分析法
胶束增敏荧光法 -环糊精包含增敏作用 鲁米诺（Luminol)等化学发光体系
二、高效液相色谱
第一部分 HPLC概述
1. HPLC的基本描述 2. HPLC的几个重要概念 3. HPLC的特点 4. HPLC的应用对象
（二）方法原理 薄层色谱分离法是将
固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制 成薄层板，试样中的各组分在固定 相和作为展开剂的流动相之 间不断地发生溶解、吸附、再溶解、 再吸附的分配过程。不同物质上升 的距离不一样而形成相互分开的斑 点从而达到分离。
（三）固定相
（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸 性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱 性硅胶扩大使用范围）
HPLC的基本描述
在经典液相柱色谱法基础上发展起来的一种 色谱方法
液相柱色谱法原理和气相色谱理论相结合的 产物
当今色谱技术中极具活力、发展迅速的的分 离分析技术
技术难度较大、不宜熟练掌握、极具挑战性 的分离分析方法
HPLC的几个重要概念
HPLC是一种分离方法，有多种分离模式
HPLC是一个连续过程
色谱的基本过程
利用不同物质在两个相（流动相和固定相）之间 具有不同的平衡分配系数来进行分离；
物质的化学、物理、物理化学性质上的差异，反 映在与固定相和流动相之间作用力上也有所差异—— 色谱分离的基础。
不同的平衡分配系数来自于不同的作用力；作用 力的不同构成了多种分离模式：
吸附 离子交换 疏水作用 键合相
按质量平衡原理，VR[A]m = Vm[A]m + Vs[A]s 两边都除以[A]m， VR = Vm + Vs ([A]s / [A]m)
= Vm + KVs = Vm(1+k’) 流动相流速恒定， tR = to (1 + k’)
塔板理论
理论塔板数 N = 5.54 (tR / W1/2)2 N是反映物质在固定相和流动相中动力学特征的 重要参数，是代表一根色谱柱效能的指标。
N保持不变，tR ，W1/2 —— “一般色谱现象” 理论塔板高度 H = L / N —— 码书原理 H 的意义？ 实际上，色谱中并不存在塔板，是一种理论假设
速率方程理论
涡流扩散 传质阻力
纵向分子扩散
流动相中传质 固定相里流动相中传质 固定相中传质
理论塔板高度 H = 2ldp + CdDm/u + (Cm+Csm)dp2u/Dm + Csdf2u/Ds = A + B/u + Cu