反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究

・综 述・

反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究

熊　鹰　蔡文琴　李希成　隋建峰

反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。反义RNA和DNA的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。反义核酸的长度可长可短,长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞,通过在细胞中进行转录而实现功能。反义寡核苷酸(an tisen se o ligodeoxynucleo tides,ODN)是短序列的单链DNA,在体外通过化学合成,与细胞内特异的靶序列互补。ODN比通过表达载体导入的方式应用广泛,而且由于它可以作为反义药物应用于临床,因此,ODN的研究已引起了广泛的重视[1,2]。Ξ一、反义ODN的作用机理及设计策略

反义ODN主要通过以下途径发挥作用:(1)抑制翻译[3、4].反义ODN通过与目标mRNA发生碱基特异性互补结合,形成杂交双链体,阻止核糖体与重要起始因子结合,使其不能启动翻译;一般以针对翻译起始区的ODN效果最佳,在此区域内可直接抑制翻译起始复合物与mRNA起始位点结合。(2)抑制转录后加工.真核生物mRNA的核内加工包括5’端加帽结构、内部甲基化、3’端加po lyA及剪接等,最后转运到胞质成为成熟的mRNA,反义ODN可影响其中的任一环节。(3)抑制DNA复制和转录.反义ODN通过在DNA结合蛋白的识别位点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋,阻止基因的转录和复制,又称为反基因ODN。理论上,反基因策略具有明显优点,因为DNA序列一般是单拷贝,较之mRNA的多拷贝,只需少量的ODN与DNA靶序列结合,即可达到较强的抑制效果。但这种策略有一定的局限性,在三聚体中其靶序列不易寻找,而且,ODN进入核内需要通过更多的屏障,并且可能造成非特异性杂交,甚至基因突变[5]。

反义ODN的设计策略主要考虑以下几方面[1、2、6、7、8]: (1)特异性反义ODN与靶核酸之间的特异性一方面与其长度和顺序有关,另一方面与活细胞中基因组和mRNA的复杂性有关。此外,针对某些序列的ODN本身也可能发生内部碱基互补形成发夹样结构,设计时应予考虑。(2)ODN长度从杂交链的稳定性来看,ODN越长越好,但过长时,不易通过细胞膜,而且与非靶序列结合机率增加,会引起非特异抑制作用。一般认为ODN的长度以15～25个碱基较为合适。

(3)化学修饰未修饰的ODN易被核酸酶降解,而且不易被细胞摄取。化学修饰包括主链修饰和末端修饰,其中主链修饰包括对磷酸、糖环和碱基的修饰及寡核苷酸构型的改变。末端修饰主要是对末端疏水基团的修饰,从而有助于寡核苷酸进入靶细胞。S2ODN均有较强的抗核酸酶的能力,能在较低的浓度下诱导RN ase H的活性,合成和纯化容易,水溶性较高,因而应用最广泛。(4)亲和性ODN对靶序列的亲和力来自相互杂交作用。结合的自由能来自两个主要方面:形成双螺旋的氢键和碱基堆积。由于GC之间的亲和力比AU之间的亲和力大,因此,增加针对GC的靶序列的碱基在ODN 的比例,可增加其杂交亲和性,而适当减少ODN的长度。(5)异抑制效应及是否存在副作用。以往的实验常用正义链(sen se)作对照,现在一般采用无义(m issen se)或反向(re2 verse)作对照。

二、反义ODN在学习记忆研究中的应用

现代分子生物学技术使研究者发现越来越多的基因在中枢神经系统表达。然而,我们对于这些基因的功能了解很少或者根本不了解。反义寡核苷酸技术能够有效的探讨这些基因的作用。R ickm an同时使用了转基因Knockou t和反义knockdow n技术研究trkb配基在视网膜神经元发育中的作用,反义knockdow n技术避免了trkb转基因操作的一些缺点,尤其是转基因小鼠出生后极低的存活率。Robertson认为反义途径比转基因技术有很多优越性,如应用范围广、具有可逆性和解剖特异性、没有复杂的发育问题以及花费较低等[2]。

学习记忆的研究需要弄清特异脑区的分子机制和由学习产生的行为修饰的因果关系,采用传统的神经电生理和生化的方法,搞清这一关系较为困难。现在通过转基因小鼠和反义核酸两个途径使我们能够研究特异的基因在学习记忆过程中的作用。本文综述反义ODN在学习记忆研究中的应用。

1.研究快反应基因在记忆中的作用

快反应基因(i m m ediately early genes,IEGs)具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变耦联起来的作用。长时记忆的形成依赖脑内RNA和蛋白质的合成,而这些与记忆相关的蛋白是由IEGs启动细胞内特异的目的基因(迟反应基因)表达的产物,有假说认为,细胞外信号激活胞浆第二信使(Ca2+,c AM P,IP3等),后者再激活IEGs的表达,进而启动目的基因的表达而形成长期记忆[9、10]。

快反应基因fo s和jun家族的表达产物是转录调节蛋白。它们通过形成二聚体复合物调节靶基因的表达。在哺乳动物中枢神经系统,c2fo s,c2jun以及其它IEGs的表达可被各种刺激包括长时程增强(L T P)、长时程抑制(L TD)以及行为训练等诱导[9]。在分辨训练以后大鼠边缘系统的c2fo s表达增多;Y迷宫训练后,大脑皮层c2jun mRNA表达明显增多;A nokh in等的实验表明小鸡c2fo s和c2jun的表达在辨别学习和被动回避学习以后增多;H eu rteaux则证实小鼠海马c2jun mRNA在食物压杆操作学习后表达增强[10～14]。理论上可用Fo s、Jun蛋白抗体来阻断其作用来研究Fo s、Jun的生理功能,但Fo s,Jun抗体不易进入细胞,特异性也不高,而IEGs反义ODN较易进入细胞且具有高选择性,对于c2fo s、c2jun等确切功能的研究是一种理想的手段。

T ischm eyer(1994)[15]研究了反义c2jun和jun2B ODN 对大鼠明暗分辨学习的影响。反义c2jun S2ODN的序列: T GCA GTCA TA GAA C,反义jun2B:T T TCGT GCA CA TCC。反义c2jun对照:T GCA CT GA TA CAA C。双侧海马埋管,

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中国行为医学科学1999年第8卷第1期