卵母细胞的冷冻技术概要
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
[指南]辅助生殖技术
![[指南]辅助生殖技术](https://img.taocdn.com/s3/m/0aaedc2d590216fc700abb68a98271fe910eaf16.png)
辅助生殖技术辅助生育技术(artificial reproductive technology，ART)是指对配子、胚胎或者基因物质等进行操作而获得新生命的技术，它包括各种帮助不孕症患者妊娠的技术，如促排卵[yao]物治疗、人工授精(artificial insemina．tion，AH)和体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization&emb~o transfer，IVFET)及其各项衍生技术。
目前在ART中的研究热点是IVF一ET及其各项衍生技术。
常规IVF一ET技术主要解决女性不孕问题，特别是输卵管性不孕；在该技术上结合显微操作技术、分子生物学、细胞遗传学等发展起来的衍生技术主要包括有胞浆内单精子注射(intracytoplasmie sperm injection，ICSI)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation geneticdiagnosis，PGD)等。
经过近20年的发展，ART已经取得了惊人的进步。
目前，我国大陆临床ART在许多方面基本上与国际水平接轨，不少中心常规IVFET的成功率已稳定在较高的水平[1]。
本文主要阐述近年IVF一ET及其衍生技术中涉及问题的研究进展。
1 常规IVF-ET常规IVF-ET是指从妇女体内取出卵子，体外培养后加入经过处理获能的精子使之受精，受精卵发育成2～8个卵裂球或囊胚后，移植入母体子宫内并使之着床。
它的适应症为女方输卵管性不孕、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫性不孕、男方轻度少精症、弱精症或畸精症、原因不明不孕特别是经过其他助孕方法多次失败。
主要程序包括控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、手术取卵、体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等步骤。
1．1 COH方案的改进。
IVF能够获得成功的大前提是获得可以进行移植的优质胚胎，COH 的目的就是提供高质量的卵子以获得更多的优质胚胎，从而提高成功率。
OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察
OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察章汉旺;任新玲;魏玉兰【期刊名称】《中国妇幼保健》【年(卷),期】2005(20)20【摘要】目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。
方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。
以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。
结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。
冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。
结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV 期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。
【总页数】3页(P2633-2635)【关键词】玻璃化冷冻;未成熟卵母细胞;体外成熟培养【作者】章汉旺;任新玲;魏玉兰【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科生殖医学中心【正文语种】中文【中图分类】R711【相关文献】1.OPS法及自制冷冻叶法玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞的研究 [J], 高静;胡泊;徐华;巩小芸;蔡霞2.冷冻平衡液及保护剂的不同组合对小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻效果的影响[J], 袁水桥;杨瑞峰;周生来;孙绪磊;郑志红3.小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术 [J], 李秀伟;吴通义;侯云鹏;周光斌;朱士恩4.绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验 [J], 田树军;闫长亮;杨慧欣;杨中强;朱士恩5.小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻保存技术的研究 [J], 罗光彬;朱增娟;袁水桥;张晓华;李东全因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
猪未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的研究
．
浙江杭州 ３１２ ；． １０ １４ 山东省日照市畜牧局， ３ 山东 日照 ２６２ ） ７８６
摘 要 研 究 了乙二醇 （Ｇ 、 甲基 ＿ Ｅ ）二 Ｅ￣（ Ｍ Ｏ 、 ， Ｄ Ｓ ）丙二醇 （Ｒ Ｈ 和甘 油（Ｌ ） ４ ＰＯ ） Ｇ Ｙ 这 种渗 透性冷 冻保护剂及其 两 两组合 对玻璃 化冷 冻未成 熟（Ｖ期 ） 卵母 细胞的影响 ； Ｇ 猪 比较 了 ３ 种不 同冻前预处理 方法和 ２ 不 同的解 冻方 法。结 果表 明 ：Ｇ组 卵母 细胞 所取 得的 成熟 率为 种 Ｅ １、 ％ ， Ｄ Ｓ ２９ ０ 与 Ｍ Ｏ组 （ ． ％） Ｅ ８ ６ 及 Ｇ和 Ｄ Ｓ ２ Ｍ Ｏ混合 组（ ．ｌ ） ９ ６ ％ 差异 不显著（ ０ ０ ） 但 明显好 于其他 各组 （ ００ ）６步预 处理 法和 ３ Ｐ＞ 、 ， ５ Ｐ＜ ． ； ５ 步预 处理法所取 得的 卵母 细胞存 活率和成熟 率显著 高于 ｌ 步预 处理 法（ ００）成 熟率分 别为 １、 ％和 ｌ、１ ３步和 ４步解 冻法 Ｐ＜ ． ， ５ ２３ ３ １ｌ％； 取得 的成熟率要 显著好 于 ｌ 步解 冻法 ， 成熟 率分别达 ｌ． ％ 、 、 ％。 ２７ ０ ｌ４ ０７ 关键词 猪 ； 卵母 细胞 ； 玻璃化 冷冻 ； 外成 熟 体 中 图分 类号 Ｑ ５ 、 ９２ ６ 文献标 识码 Ａ 文章编号 ０ １ — ６ １２ ７ ｏ — １６ — ３ ５ ７ ６ １（ｏ ） ０６５ ０ ｏ ６
Ｋｅ ｒ ｓ Ｐ ｒｉｅ Ｏｏ ｙｅ Ｖｉｉ ｃｔ ｎ Ｍａｕ ａｉｎ ｙ ｗｏ ｄ ｏｃｎ ； ｅ ｔ； ｔｆａ ｉ ； ｔｒｔ ｒｉ ｏ ｏ
第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NYT1900-2010
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
山羊卵母细胞冷冻保存技术研究
ｗａ ．％， ．％ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｉ ｏ ￣ｅ ｆ ，ｈ ｔｒｔ ｎ ｒｔ ｓ２ ．％， ２０ ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ Ｔ ｅ ｓ６３ ９ １ ｅ ｐ ｃｉ ｌ；ｎｏ ｃ ｓｏ ｈ ｔｅｍａｕａｉ ｅｗａ ０５ ３ ．％，ｅ ｐ ｃｉ ｌ． ｈ ｖ ９ ｏ ａ ｖ
ｆ｝ ｉ ａ ｉ ａ ｅ ｗａｓ５． ％ ，１ ７％ ， ｅ ｐ ｃ ｉｅｙ ｎ ｌ ｅｒｌ ｔ ｔ ｉ ｏｎ ｒ ｔ ｚ １ ０＿ ｒ ｓ ｅ ｔ ｌ；Ｉ ＶＭ ｃ ｔ ｓ，ｈ ｅ ｉｚ ｔ ａ ｅ ｗａｓ２１４％ ， ０． ｖ ｏｏ ｙ ｅ ｔ ｅ ｆ ｒ ｌ ａ ｉ ｒ ｔ ｔ ｉ ｏｎ ． ３ ３％，
中图 分 类号 ：￥ ２ ．５ ８７３ 文 献标 志 码 ：Ａ 文章 编 号 ：１ ０ — ３ ９ ２ １ ）９ ０ ０ — ６ ０ ５ ９ ６ （ ０ ２０ — ０ ０ ０
Ｓｔｄ ｎ ｃｙ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｎ ｔ ｃ ｎ ｏ ｙ ｏ ｏ ｔｏ ｃ ｔ ｓｘ ａｎ ｇ Ｈ Ａ Ｇ ｕ ｙ ｏ ｒｏ ｒ ｓ ｒａ ｉ ｅ ｈ ｏｌｇ ｆｇ ａ ｏ ｙ ｅ ／ｕＤ ｎｉ ， Ｕ Ｎ ｏ ｎ
收 稿 日期 ：２ １－ ２ ２ ０ １ １－ ０
基金项 目： 农业部公益性行业 （ 奶山羊 ） 科研专项 （０ １３ ３ ） ２ １０ ０ ８ 作者简介 ：许丹 宁（９ ８ ） １７ 一 ，女 ，副教授 ，博士 ，研究 方向为动物 营养及生殖生理。Ｅ ｍ ｉ ｘ ａｎｎ ＠１６ ｃｒ — ａｌ ｄｎ ｉｇ ２ ．ｏ ： ｎ 通讯作者 ：田允波 ，教授 ，博士生导师 ， 研究方 向为动物生殖生理及繁殖生物技术 。Ｅ ｍ ｉ ｔ ｎ ｏ ２ ．ｏ — ａ ： ｕ ｂ＠１６ ｃｒ ］ｙ ｎ
冷冻卵子疾病PPT演示课件
基因筛查和诊断
结合基因检测技术，对冷冻卵子 进行基因筛查和诊断，为客户提
供更加个性化的生育方案。
生育能力评估
根据客户的年龄、身体状况等因 素，为其提供生育能力评估服务 ，制定针对性的冷冻卵子方案。
心理辅导和支持
针对客户在冷冻卵子过程中可能 出现的心理压力和情绪波动，提 供心理辅导和支持服务，帮助其
度过难关。
05
冷冻卵子伦理道德问题探 讨
生命起源与尊严维护
生命起源尊重
冷冻卵子技术可能干预自然生殖过程， 引发对生命起源的尊重问题。一些人认 为，通过技术手段操控生命起源是对自 然的不尊重。
VS
人类尊严维护
将卵子冷冻保存，可能引发关于人类尊严 的争议。一些人担忧，将生殖细胞视为商 品进行买卖或长期保存，会降低人的尊严 和价值。
保存生育选择权
对于一些可能影响生育能力的职业， 如军人、消防员等，冷冻卵子可以为 她们保存生育选择权，让她们在职业 发展和家庭建设之间取得平衡。
遗传疾病风险规避
降低遗传疾病风险
通过基因筛查和诊断，可以选择不携带遗传疾病基因的卵子进行冷冻和保存，从而降低后代遗传疾病的风险。
实现优生优育
结合遗传咨询和基因检测技术，可以为有遗传疾病家族史的家庭提供定制化的生育方案，实现优生优育的目标。
• 发展历程：自1986年世界上首名慢速冷冻卵子宝宝诞生起，冷冻卵子技术至今已有30余年历史。
冷冻技术原理简介
玻璃化冷冻法
把卵子放进高浓度渗透液中，然 后立即储存到-196℃的液氮中。
程序化冷冻法
把卵子放在程序冷冻仪里，经过 逐步降温后储存到-196℃的液氮 中。
适应症与禁忌症
适应症
女性因各种因素导致卵巢早衰或绝经提前；女性因染色体、自身免疫疾病、感染 、肿瘤等因素导致卵巢受损；女性需接受化疗、放疗或骨髓移植等手术，可能导 致卵巢受损或不孕；有性传播疾病者；患有其他严重疾病者。
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识(2023年)
最新：人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识（2023年）摘要人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分。
由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，参考最新国际指南和共识，结合中国临床实践现状，经充分讨论后形成该共识，旨在加强玻璃化冷冻技术质量控制，进一步改善卵母细胞及胚胎冷冻结局，提升辅助生殖服务质量。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要环节。
相较于传统的程序化冷冻，玻璃化冷冻技术以其简单快速、不依赖昂贵设备，且复苏率极高的显著优点，在国内外各大生殖医学中心迅速普及推广，从而为人类生育力保存、胚胎植入前遗传学检测以及全胚冷冻策略的广泛临床应用，提供了必要的核心技术支持。
卵母细胞及胚胎的冷冻复苏结局受诸多因素影响，包括冷冻保护剂种类、样本平衡时间、降温/升温速率和冷冻载体类型等，造成各生殖中心间冷冻结局的差异。
有鉴于此，参考最新指南和共识［1-7］，结合中国临床实践，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，组织本领域专家对人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻技术流程和细节进行归纳总结，以期提供一套全面系统的玻璃化冷冻操作规范指导意见，提升生殖医学中心服务质量。
一.人员资质培训初学者培训采用导师负责制，以经验丰富的胚胎学家作为指导老师，由指导老师依据质控指标和经验判断初学者达到标准后，方可进入下一阶段培训。
整个培训过程形成书面记录存档。
1.理论学习：初学者应理解玻璃化冷冻的基本原理，掌握冷冻保护剂浓度、操作温度、降温/升温速率等基本概念及控制方法［8］。
2.动物样本：建议初学者在指导老师监督下使用动物样本进行为期1~2个月的培训。
以小鼠8-细胞胚胎为样本不断练习冷冻和解冻操作，以熟练掌握试剂耗材的使用方法［8］。
鉴于小鼠胚胎对冷冻和解冻操作的敏感性低于人类胚胎［9］，建议对初学者的要求设为操作50例小鼠8-细胞胚胎的复苏率不低于同中心人类卵裂期胚胎（第3天）复苏率，且复苏后的小鼠8-细胞胚胎需继续培养24~48 h，其囊胚形成率应≥80%［10］。
第五章 动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
一、卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存 ，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因 而冷冻保存的难度较大。 在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤 ，主要包括在以下几个方面：
（二）胚胎冷冻保存的发展概况 胚胎的冷冻保存开始于1972年， 由Whittingham 首次在小鼠上取得成功。
此后，国外在牛（Wilmut等，1973）、绵羊
（Willadsen等，1974）、山羊（Bilton等，1976） 和马（Ramamato等，1982）等动物的冷冻胚胎移 植方面相继取得成功。
储存于液氮内的细胞，需要解冻到常温后才 能应用。若升温的速度不够快，储存的细胞 从液氮温度回升到成核温度时，细胞会从周 围吸热，热力学发生变化后出现再结晶现象 ，即发生所谓的“去玻璃化”现象。 去玻璃化过程有两种类型： 一种是原来降温过程中形成的微小冰核在升 温的过程中形成冰晶； 另一种是没有微小冰核的标本中在复苏的过 程中形成冰核并结晶生长。
5、冷冻保护剂化学毒性损伤 当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时 ，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下 降。造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗 透性冷冻保护剂的化学毒性作用。 冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影 响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结 构和功能，间接引起高级结构的破坏。毒性 表现在引起细胞膜变脆或破裂、透明带硬化 、微管及微丝聚合或解聚、染色体和DNA损 伤等。
6、低温损伤 卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度 高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍 会造成细胞的损伤。 不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到 一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母 细胞和牛卵母细胞。 这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被 称为低温损伤。这种损伤很大程度上取决于温度 的变化。造成这种损伤的机理可能是的低温引起 膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。 低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪 和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他 哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
最新卵巢组织冷冻与移植的研究进展综述(全文)
最新卵巢组织冷冻与移植的研究进展综述（全文）摘要：随着现代医学科学技术的快速发展及人类生育力水平的下降，女性患者的生育力保护日益受到学界的广泛关注。
在现有女性生育力保护的辅助生殖技术中，卵巢组织冷冻与移植技术经过不断完善与发展，已从一个实验性的技术变为临床应用逐渐增加的生育力保存方法。
本文从卵巢组织冷冻的优势、卵巢组织冷冻与移植的技术难点、卵巢组织移植的安全性问题、未来的研究发展方向与应用等几个方面，对卵巢组织冷冻与移植技术的进展做一综述。
关键词：卵巢组织冷冻；卵巢组织移植；生育力保存随着科学技术的发展，辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）的应用越来越广泛，并且取得了很大的进展。
然而，不孕不育仍然是困扰育龄人群正常生活的重要问题。
目前，世界范围内的不孕不育率高达15%～20%。
导致女性生育力下降的内因包括卵巢或卵发育异常、癌症等病变治疗导致的卵巢损伤的发生率增加、低龄化、治疗水平提高、长期生存率增加等[1-2]；导致生育力下降的外因包括社会压力增加、饮食结构改变、不恰当使用避孕节育措施、育年龄后延、环境污染、长期接触过量的放射物质、接触有毒物质的特殊职业者等。
鉴于不孕不育对人口长期发展的影响，以及人类生育力近年来持续下降的趋势，生育功能逐渐降低正成为关系人类繁衍发展的社会重大问题，生育力保护也因此受到越来越多专家、学者的关注和重视，成为生殖医学领域备受关注的热点。
近年来，癌症早期诊断和治疗方法日趋进步，使得年轻癌症患者的死亡率大大降低。
我国的恶性肿瘤发病和死亡统计结果显示：女性恶性肿瘤发病率在20岁以前处于较低水平，而到育龄期（20～40岁）之后随着年龄的增加快速升高，其中女性乳腺癌的发病率近年来呈上升趋势，乳腺癌已成为我国第二大常见肿瘤。
女性癌症幸存者所接受的放化疗可导致卵泡池耗竭、血管损伤，使其发生绝经提前和原发性卵巢功能不足的风险增加[3]。
胚胎冷冻保存技术
常规冷冻法
（2）植冰（诱发结冰）：
植冰的概念：在液氮中冷却后的镊子或棉签夹 住塑料细管上端（棉栓端），使抗冻液迅速 通过－6℃左右冰点，强制性地使细胞外液 形成冰晶，称之为植冰。
目的：当温度降到抗冻液冰点附近时，经植冰 迅速冻结，以防胚胎细胞内部产生冰晶，给 胚胎造成物理性的损伤，致使胚胎死亡。 将胚胎移入事先配置好抗冻液的0.25毫 升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至 －6℃左右时，用上述方法诱发结冰。
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
损伤保护
• 诱发结晶
在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成和剧烈 的温度变化。诱发结晶主要在降温速率较慢的冷冻方法中使用。诱发 方法有两种：①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液 上部；②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。
⑵ 非渗透性：蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、PVP和聚蔗糖等，
降低胚胎外液的冰点，减少胚胎外冰晶形成，并能促使
胚胎内部的水分外流，从而最终减少胚胎内部冰晶的形
成。
特点：分子量大，不进入细胞
损伤保护
• 诱发结晶 • 使用冷冻保护剂 • 玻璃化
玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相 时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外 表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚 细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。
冷冻过程
三，保存 • 常规冷冻法
• 一步冷冻法
• 玻璃化冷冻法
常规冷冻法
• 历史：1972年首先获小鼠胚胎冷冻成功； 1973年牛的胚胎冷冻后获得成功，并
产下后代。 • 操作流程：
（1）抗冻液中平衡：室温下（20-25℃），
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究
奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究摘要：随着现代农牧业的发展，奶牛是重要的家畜之一。
为了提高奶牛的繁殖效率，玻璃化冷冻方法和胚胎程序化冷冻技术被广泛应用于奶牛卵母细胞和胚胎的保存和繁殖。
本文综述了奶牛卵母细胞玻璃化冷冻方法及胚胎程序化冷冻研究的进展。
关键词：奶牛；卵母细胞；玻璃化冷冻；胚胎；程序化冷冻引言奶牛是重要的农业家畜之一，其繁殖效率的提高对于农牧业发展具有重要意义。
过去几十年里，冷冻技术在畜牧业中得到了广泛应用。
其中，玻璃化冷冻方法和胚胎程序化冷冻技术在奶牛卵母细胞和胚胎的保存和繁殖中发挥了重要作用。
玻璃化冷冻方法玻璃化冷冻方法是一种常见的细胞冷冻方法，其原理是将细胞中的水分子冷冻成无定形的玻璃态，从而避免冷冻中的细胞结冰损伤。
玻璃化冷冻方法首先需要对卵母细胞进行预处理，例如使细胞适应低温环境等。
接着，在添加适宜浓度的保护剂的条件下，将细胞悬浮液快速冷冻至低温，并迅速回到室温。
最后，将冷冻的细胞存储在液氮中。
玻璃化冷冻方法具有简单、方便、安全等优点，现已广泛应用于奶牛卵母细胞的保存和繁殖。
卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究也在不断进展中。
研究人员发现添加适宜浓度的保护剂对玻璃化冷冻的卵母细胞具有重要影响。
保护剂的添加能够减少细胞的冷冻损伤，提高细胞的存活率。
同时，不同类型的卵母细胞对保护剂的敏感性也不尽相同。
例如，多数研究表明胚珠囊泡期的卵母细胞对保护剂敏感，而其它期的卵母细胞对保护剂的敏感性较低。
因此，在卵母细胞玻璃化冷冻方法的研究中，保护剂的选择和浓度的优化是关键的研究方向。
胚胎程序化冷冻技术胚胎程序化冷冻技术是一种较新的冷冻技术，通过程序化的步骤将胚胎冷冻为不同的细胞阶段，从而提高胚胎的存活率和发育潜力。
胚胎程序化冷冻技术常用于人类试管婴儿辅助生殖技术中，但在奶牛的繁殖中也有潜在应用价值。
胚胎程序化冷冻技术的关键是冷冻时的胚胎阶段的选择。
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三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。