卵母细胞的冷冻技术概要

三、实验
3.卵母细胞解冻：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
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二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存 l周。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。