【定量数据分析】荧光定量PCR技术_常见问题与解答

螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。

常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。

本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。

荧光基团第一章理论篇一、荧光定量PCR 技术发展史1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。

当时他使用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。

1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。

近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。

由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。

二、荧光定量PCR 概述1、荧光定量PCR 概念所谓定量PCR技术（r eal-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。

图1 荧光定量PCR 反应原理荧光检测元件Ct值2、荧光定量PCR 与普通PCR 的主要区别常规PCR 中，PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR 只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图2）；荧光定量PCR 中，PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR 产物的实时检测成为可能。

相对常规PCR 而言，荧光定量PCR 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；图2 终点法定量PCR 的缺陷理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。

这是因为随着PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。

当所有的Taq 酶都被饱和以后，PCR 就进入了平台期。

由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。

所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。

常规PCR 的定量方法，测定的都是PCR 的终产物，而不是起始DNA 拷贝数。

由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR 产物的量直接计算出起始DNA 拷贝数。

虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

而从图2 也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行96 次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR 中Ct 值的重现性，恒定的Ct 值为荧光定量PCR 的分析提供了理论依据。

前面我们对荧光定量PCR 的历史、荧光定量PCR 概念和与常规PCR 区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct 值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR 反应中的Ct 值，原理是什么？。

为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR 技术，在介绍荧光定量PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。

3、荧光定量PCR 的几个基本概念3.1 扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。

描述PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。

PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S 型曲线（图3）。

图3中，X－轴表示PCR循环数，Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。

图 3 荧光定量PCR 扩增曲线示意图荧光阈值从图3 可以很直观的看出，荧光定量PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。

在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。

只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

3.2 荧光阈值在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3），我们一般把荧光PCR 的前15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。

荧光阈值是（机器自动设置）。

我们在做荧光定量PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）。

图4 手工调整荧光阈值示意图3.3 Ct 值了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。

C 代表Cycle，t 代表threshold，所谓Ct 值就是在荧光PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

如图3 所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct 值。

从这也可以了解到Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。

而荧光定量PCR 后面的数据处理要用到Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。

一般说来，新手按荧光PCR 仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。

因为Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。

正常的CT 值范围在18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。

前面也提到过，同一模板经过96 次PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。

根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct 值做出标准曲线，只要在同一次PCR 实验中得到未知样品的Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。

接下来我们就来看看通过Ct 值算出拷贝数的数学原理是怎样的：首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图5），从PCR原理图中我们也可以很清意位置上，荧光域值的缺省设置是3 ～15 倍10个循环的荧光信号的标准偏差的楚的知道理想的PCR反应是以2n次方增长的方式扩增，即：X=X0×2n但由于PCR 反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到PCR 反应体系中的物质是有限的，例如酶、引物、Buffer 等，只有在对数增长期时，PCR 的扩增效率才等于1，大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。

因此PCR 扩增的真正情况是：X=X0 (1+Ex)n其中n：扩增反应的循环次数；X：第n 次循环后的产物量X0：初始模板量；E x：扩增效率在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，此时的产物量为X Ct=X0 (1+Ex)Ct =M其中X Ct：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后, 它是一个常数，我们设为M，对方程式两边同时取对数得logM=logX0 (1+Ex)Ct，我们对该方程式做简单的数学运算后得到：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M其中M 为常数，Ex 为常变数，也就是说Ex 在PCR 反应中的某一个循环中是一个常数，但不同的循环数中，Ex 的数值会发生变化。

因此从上式可以推出：Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。

图 5 PCR 原理图3.4 标准曲线在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct 值推算出。

在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释个（5－6稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR 实验中2得n＝Ct，3.32 值差3.32。

进行反应，将稀释标准品得到的Ct 值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（图6）。

标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。

理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（图6 左），如果PCR 反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式“ n＝稀释倍数”，n为2 样本间Ct值差。

例如：10 倍稀释的样本，2n＝10，可图 6 荧光定量PCR 标准曲线示意图3.5 扩增效率在绝对定量中，我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR 实验，利用拷贝数和Ct 值做成标准曲线，利用递减的直线关系等式和相关系数（r）或可信度来计算扩增效率。

扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E -1/斜率。

理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2 倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。