【定量数据分析】荧光定量PCR技术_常见问题与解答

螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术

PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。

常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。

本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。

荧光基团第一章理论篇

一、荧光定量PCR 技术发展史

1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对

目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。当时他使

用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV

射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数

学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但

由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物

同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。

1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光

定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，

荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。

近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具

有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于

基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。

二、荧光定量PCR 概述

1、荧光定量PCR 概念

所谓定量PCR技术（r eal-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知

模板进行定量分析的方法（图1）。

图1 荧光定量PCR 反应原理

荧光检测元件

Ct值

2、荧光定量PCR 与普通PCR 的主要区别

常规PCR 中，PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR 只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图2）；荧光定量PCR 中，PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR 产物的实时检测成为可能。相对常规PCR 而言，荧光定量PCR 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；

图2 终点法定量PCR 的缺陷

理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。这是因为随着PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq 酶都被饱和以后，PCR 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。

常规PCR 的定量方法，测定的都是PCR 的终产物，而不是起始DNA 拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR 产物的量直接计算出起始DNA 拷贝数。虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

而从图2 也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行96 次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR 中Ct 值的重现性，恒定的Ct 值为荧光定量PCR 的分析提供了理

论依据。

前面我们对荧光定量PCR 的历史、荧光定量PCR 概念和与常规PCR 区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct 值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR 反应中的Ct 值，原理是什么？。。。。。。

为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR 技术，在介绍荧光定量PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。3、荧光定量PCR 的几个基本概念

3.1 扩增曲线

为了更好的理解荧光定量PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S 型曲线（图3）。图3中，X－轴表示PCR循环数，Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。

图 3 荧光定量PCR 扩增曲线示意图

荧光阈值

从图3 可以很直观的看出，荧光定量PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

3.2 荧光阈值