饲料中维生素A和维生素E含量的测定

饲料中维生素A和维生素E含量的测定

1-原理

将具有代表性的样品皂化井用己烷抽提后，用HPLC分析。维生素E在292nm测定，维生素A在325nm测定

2-安全措施

全部过程中必须戴护目镜

特别应注意:

-溶剂的挥发性气体，应在通风橱内工作

-具腐蚀性的试剂，例如强酸和强碱

3-试剂

全部使用分析纯试剂;水必须是蒸馏水或相当品质

3.1-氮气

3.2-粒状氢氧化钾

3.2.1-50%(质量/质量)氢氧化钾水溶液

3.3-乙醇

3.4-己烷

3.5-硫酸，密度=1.83

3.5.1-80%(质量/质量)硫酸溶液

3.6-无水硫酸钠

3.7-碳酸氢钠

3.7.1-5%碳酸氢钠水溶液

3.8-HPLC级己烷

3.9-HPLC级2-丙醇

3.10-全反式维生素A标准物

3.1l-维生素E醇类(a-生育酚)标准物，例如，FLUKA公司标准

物Ref.No.95 240

4-仪器

-可在325nm处测定的紫外分光光度汁

-常规实验室玻璃器皿和用具

-专用特制玻璃器皿(附图

-HPLC，装备有泵，自动取样器，进样器和能在325nm处进行检测的

检测系统

-旋转蒸发仪

-水浴锅

5-步骤

注意:不能在自然光，荧光或氖灯下操作，而且要隔绝与空气的接触

(抽提是在充氮条件下进行，玻璃器皿为可吸收紫外线的棕色器皿，照明

为白炽灯，或在窗户上装备了紫外滤光屏卜

5.1-制备溶液

5.1.1-维生素A醇标准液

-精确地(土0.01毫克)称取约含有25，侧灿的维生素A乙酸酷(3.10)。

-将维生素A乙酸酷转移至1叨毫升的沸腾管(见附图1)中;

-加入25毫升乙醇(3.3)和3毫升氢氧化钾溶液(3.2.1);

-在沸腾管「加上冷凝管，在水浴锅上沸腾叨分钟;

-冷却，用己烷(3.4)抽提数次. 用己烷(3.4)稀释，使最终浓度达10-15 IU/毫升;

-准确测定该溶液所含有的视黄醇浓度，测定方法是用光径为1厘米的

石英比色怀测定此溶液在325皿处的光吸收值(A)，用已烷(3.·4)作空白对照:

用公式计算:

含量C(m/毫升卜Axl8·3

5.1.2-维生索E醇标准物溶液

-精确地称取25毫克=0，01毫克的维生素E醇(3.11

放入50毫开容量瓶;

-用已烷(3.4)定容至刻度;

-用取液器取该溶液5毫升，放入另一个50毫升容量瓶中

-用已烷(3.4)定容至刻度;

5.1.3-待测样品液-溶液A和溶液E

-称取研磨的极细的样品200克+-0.1克，放人2升的容量瓶中;

-加入1升乙醇(3.3)和100毫升氢氧化钾溶液(3.2.1);

-把容量瓶称重;

-记录质量M1;

-摇动;

-在容量瓶「加上水流冷凝管.将其放在容量瓶加热器上加热，煮沸25

分钟;

-用水流冷却至溶液平静为止;

-加入乙醇(3.3)使其质量重新达到MI

-取上清液50毫升放人沸腾管(附图1)中;

-加入40毫升水月4x30毫升已烷(3.4)抽提;

-将抽提物放人分液漏-斗，用2x100毫升冰洗涤至中性;

-在无水硫酸钠(3.6)上过滤

-蒸发毛干燥，迅速溶解于25毫开己烷;

-取5毫升该溶液用于维生素A的测定:该溶液为溶液A.

-在剩下的20毫升溶液中加入20毫升已烷，转移至100毫升沸腾管中; -加入10毫升80%硫酸溶液(3.5.1);

-振荡完全;

-待溶液完全静止后，将巳烷层转移至分液漏斗;

-用4x30毫升巳烷(3.4)抽提硫酸层

-把所有己烷抽提液放人分液漏斗中·用5毫升无水碳酸氧钠溶液(3.7.1) 冲洗，然后用2x200毫升水冲洗直至中性;

-在无水硫酸钠上过滤;

-蒸发至干燥，然后迅速用准确容量的己烷(Ve)溶解(记录Ve)使最终维

生素E醇类的浓度约为0.05毫克/毫升:该溶液为溶液E.

5.2-色谱分析

-维生素A

-按附图2所示加入标准液(5.1.1)不溶液A.

-维生素E

-按附图2所述注入标准液A(5.1.2)和溶液E

6-计算结果

维生素A(IU/克)

变量:

C=标准液(5·1·1)的浓度含量，弟位为因际单位IU叨/毫开

Ar(反式)=朋标准液(5·1·1)所得到的全反式视黄醇的蜂的面积

Ae(反式)=溶液A所得到的反式视黄醇的峰的面积

Ae(顺式)=溶液A所得到的顺式视黄醇的峰的面积

Ve=待测液的最终体积25毫升)

Me=样品的质量，单位为克

1.087=13-顺式视黄醇的响应参数

1100=皂化反应中的总体积

50=抽提所用的体积

C[Ae(反式)+1.087xAe(顺式)lx Ve x1100

维生素A含量(IU/克) =

Ar(反式)x 50 xMe

维生素E乙酸醋(毫/肘克)

变量:

P=维生素E醇类标准液(3.11)的浓度含量

Mr(反式)二溶液(5.1.2) 中所含的维生素邱享类标准物的质量，单位为毫克Ae=待测溶液E所得到的维生素E的峰的面积

Ve=侍测溶液酣勺最终体积

Vr=际准液(5·1·2)的最终体积(通常为5叨毫升)

Ar=用际准液(5·1·2)所得到的维生素E醇类物的峰的面积

Me=样品的质最，兑位为克

1100=皂化反应中的总体积

50=抽提所用的体积

1.25=纯化之前的体积与硫酸抽提体积之比，本文中应为25:20□·25

1.1=分子最的校正系数(维生素E乙酸酯/维生素E醇类)

P x Mr x Ae x Ve x 1100 x 1·25 x 1.1

维生素E含最(毫克/克) =

Vr x Ar x Me x 50