植物组织培养人工种子和 种质保存课件

2、常用的人工胚乳液配方有两种： • MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马
铃薯淀粉水解物； • SH（0.5×）培养基加入1.5%的麦芽糖。
3、包埋的方法
主要有液胶包埋法、干燥包埋法 和水凝胶法
等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬 浮在”
一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。干燥 包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等 聚合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通过 离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进行
• 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数体 细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态 凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而 维持良好的发芽能力。
四. 人工种子的意义
• 其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高 效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种 性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；
表7.1 以体细胞胚为繁殖体的人工种子
物种 胡萝卜(Daucus carota) 苜蓿(Medicago sativas) 芹菜(Apium graveolens) 柑橘(C. sinensis×C. reticulata) 挪威云杉(Picea abies) 松树(Pinus lambertiana, P. aeda) 玉米(Zea mays) 杂交水稻(O. sativa×O. lalifolia) 橡胶树(Hevea brasiliensis) 西洋参(Panax quinquefolium) 刺五加(Acanthopanax senticosus) 黄连(Coptis chinensis)
海藻酸钠易失水干缩，为克 服此弱点，采用二重结构，即在 胶囊中包埋培养液、保水剂，使 体胚悬浮于培养基中，为防止发 芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。
三．人工种皮的装配
理想的人工种皮应该是： • 具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分
不易流失，同时又具有良好的透气性。 • 具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运
理，或在冷冻防护剂存在下进行预培
养，或直接进行低温（-3—10℃）预 处理。
（2）冷冻处理
冷冻处理的方法有快速冷冻法、 慢速冷冻法、预冷冻法和干燥冷冻法。
a、快速冷冻法
指将植物材料从0℃或者其他预 处理温度直接投入液氮中保存的方 法，降温速度为1000℃/min。
要求细胞体积小、细胞质浓厚、 含水量低、液泡化程度低的材料。
基本措施是控制保存材料所处的 温度和光照。
延缓保存材料生长速度的另一项 措施是改变培养基的成分。
种质库要定期检查，保持清 洁，及时清除污染材料，并注意 积累资料。
（二）超低温保存 即冷冻保存，一般以液N2为冷
源，使保存温度维持在-196℃。
1、保存原理 低温冰冻过程中，如果生物细胞
内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆 的破坏，导致细胞和组织死亡。植物 材料在超低温条件下，冰冻过程中避 免了细胞内水分结冰，并且在解冻过 程中防止细胞内水分次生结冰而达到 植物材料保存目的。
主要结果 有菌土壤中发芽成苗 有菌条件下发芽成苗 有菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌及有菌条件下发芽 无菌及有菌条件下发芽 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌条件下发芽 无菌及有菌条件下成苗 无菌及有菌条件下成苗
表7.2 以器官为繁殖体的人工种子
物种 印度桑(Morus indica) 檀香(Santalum ablum) 花叶芋(Caladium bicolor) 百合(Lilium) 直杆桉树(Eucalyptus maideni) 莴苣(Lacyuca sativa) 华腺萼木(Mycetia sienensis)
还避免了种子携带病原菌的危险；
其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难， 且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运
输。
五、人工种子的局限性 目前，绝大多数人工种子 发芽需要无菌条件，所以，还 不能实现广泛应用。另外，人 工种子的制作费用过高，并且 在应用上需要各个环节的配套， 这些都限制了人工种子的推广。
二．繁殖体的包埋
1、包埋介质的要求： • 首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具
有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输 和种植操作中的安全。
• 同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质， 以供繁殖体发芽的需要。
• 此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到 微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀 菌剂。
具体保存方法有四种：种植保存、 贮藏保存、离体保存和基因文库保存。
超 低 温 库
二、种质资源离体保存
离体保存方法： ◆低温保存 ◆超低温保存 ◆生长抑制剂保存
（一）低温保存
一种缓慢生长保存方法，是通过 控制培养温度来限制培养物各种生长 因子的作用，使培养物生长减少到最 低限度。
低温保存的基本特征是保存材料 的定期继代培养，不断繁殖更新；
究。
一．繁殖体的处理
• 体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过 一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再 将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用 ABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于长 期贮存。
• 微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要 适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进 行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延 长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休 眠处理。
大花蕙兰(Cytobium) 石槲兰(Dendrobium) 唐菖蒲(Gladiolus hortalans) 香蕉(Musa acuminata) 杨树(Populus beijingy)
繁殖体 芽 芽 芽
小鳞茎 侧芽
芽 微芽
原球茎 原球茎 球茎 微芽
芽
主要结果 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌条件下发芽成苗 无菌及有菌条件下发芽成苗 有菌土壤中发芽成苗
保存类型有两种，即原生境保存和 非原生境保存。
1、原生境保存
将植物的遗传材料保存在它们的 自然环境中。原生境保存的地方多是 植物保护区，另一种方法为农田种植 保存。
珍 宝 岛 国 家 级
自 然 保
护 区
美国、马里兰、农田
2、非原生境保存
将植物的遗传材料保存在不是它们 的自然生境的地方。
非原生境保存方式有植物园、种子 库、种质圃、试管苗库、超低温库等。
植物细胞含水量大，冰冻保存
难度大，投放液N2中易引起组织 和细胞死亡，故须借助于冷冻防护
剂，防止细胞冰冻或解冻时引起过 度脱水而遭到破坏，保护细胞。
超低温冰箱
2、基本程序 超低温保存的基本程序包括
预处理、冷冻处理、冷冻贮存、 解冻和再培养。
（1）预处理 为保证茎尖在液N2处理后具有稳
定且高的存活率，需进行一定的预处
茶树
华腺 萼木 兰花
体细 胞胚
不定 芽
体细 胞胚
不定 芽 原球 茎
Step I, 28 Step II, 30 25 Step I, 25 Step II, 20 25 25
MS, 4%
0.5-1.0
1.0
MS, 2-3%
1.0
MS, 2-3%
1.0
1.0
MS, 3%
1.0
0.2
MS, 0.2-0.3%
• 广义 而言，人工种子是在胚状体或一块
组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等） 之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用 具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来， 形成的与天然种子相似的颗粒体
二、人工种子的结构
• 农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、 胚乳和胚三部分构成。
• 目前研制的人工种子的结构:
MS, 3% MS, 3% MS, 3%
2.0
1.0
1.0
0.1
1.0
0.5
0.05-0.2
5.0
LH(100)
LH(100), 谷氨酰 胺(500)
桉树
体细 胞胚
微芽
Step I, 20 Step II, 28-56 25
B5, 4-5% 改良H, 3% 改良H, 3%
2.0-4.0
0.2-0.5 0.2-0.5
性和适于机械化操作。 • 无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。 • 配制简单易行，成本低。
常用的人工种皮材料
• 早期使用Elvax 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果 不尽人意。
• 新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和 微亲水的Cab-O-Sil，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊 外层，操作时只需将胶囊在上述材料中滚动即可完成包被过 程，操作简单易行，大量生产还可以机械化操作。
• 最近还报道一种硅酮种衣，它不仅可以抗真菌，而且可渗入 水蒸气和氧气，这些材料均还处于试验之中。
人工种子还在继续研究中，目前还不能 大面积用于生产，因为还存在着难题：体 细胞胚诱导及其可能发生变异；人工种皮 还存在缺陷；贮藏、发芽技术尚待解决； 人工种子工厂化生产配套设施、及种子成 本过高等。这些问题一旦解决，人工种子
包埋的方法。
4、以海藻酸钠作包埋剂的操作程序是：
• 在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加 入繁殖体并混匀。（添加糖、防腐剂、抗生 素、农药等，防止病虫害侵染。）
• 将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经 20－30min.的离子交换作用即形成含有繁殖 体具有一定刚性的人工种子，
• 用无菌水漂洗20min.以终止反应。
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表7.3 部分植物繁殖体诱导培养条件
植物 种类
繁殖 体类 型
培养程序 及培养天 数
培养基 及蔗糖 浓度
激素浓度（mg./L）
其它成分
2,4-D
NAA
Zeatin
BA
Kin
(mg/L)
芥菜 型油 菜
体细 胞胚
微芽
Step I, 21 Step II, 21 21
植物组织培养人工种子和种质保存
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植物组织培养
人工种子和种质保存
大 家 好 ！
人工种子
§1. 人工种子的概念 §2. 人工种子制备的技术要点
§1.人工种子的概念
一. 基本概念
• 狭义 的概念是指植物离体培养中产生的
胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在 含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜 条件下能够发芽出苗的颗粒体。
• 其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而 快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难 的植物更具有主要的适用意义；
其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物 材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可
能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；
其四，与田间制种相比，可以节省制种用地， 且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时
体细胞胚 人工种皮 人工胚乳
• 广义的体细胞胚由组织培养中获得 的体细胞即胚状体、愈伤组织、原 球茎、不定芽、顶芽、腋芽、小鳞 茎等繁殖体组成。
• 胶囊之外的包膜称之为人工种皮, 有防止机械损伤及水分干燥等保护 作用。包裹成功的人工种子既能通 气、保持水分和营养,又能防止外 部一定的机械冲击力。
的应用将会展现广阔前景。
人工种子长 出的芹菜味 道非常鲜美
黄连 黄连
西洋参 西洋参
莴苣
•
甘薯
橡胶树
苜蓿
•
檀香
植物种质资源的保存
一、概念及保存类型
植物种质资源保存是指利用天然或 人工创造的适宜环境保存种质资源，使 个体中所包含的遗传物质保持其遗传完 整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特 性传递下去。
0.2
MS, 2-3%
0.01
MS, 2%
0.1
1.0 0.5 0.52.0 0.5 0.5
1.0 1.0 0.2
ADE(40) ADE(40)
GA(0.3), IAA(0.3-0.5) IAA(0.3)
IAA(0.3), GA(0.1) 椰子汁(10%)
§2.人工种子制备的技术要点
人工种子的基本制作流程 外植体的选择和消毒—— 愈伤组织的诱 导——体细胞胚的诱导 ——体细胞胚的 同步化——体细胞胚的分选——体细胞胚 的包裹(人工胚乳)——包裹外膜——发芽 成苗试验——体细胞胚变异程度与农艺研
• 人工胚乳一般由含有供应胚状 体养分的胶囊组成,养分包括矿
质元素、维生素、碳源以及激 素等。
根据Reden三ba.u人gh工对人种工子种分子的类分类方法，可将
人工种子分为三大类：
• 裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。 它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。
• 人工种皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球茎 等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可 维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。