基因工程的酶学基础
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HpaⅠ C CGG HaeⅢ GG CC AvaⅡ G GWCC EcoRⅡ CCWGG BamHⅠ G GATTC SmaⅠ CCC GGG Bg1Ⅰ GCCNNNN NGGC BstXⅠ CCANNNNN NTGC N=A, T, G, C
生命科学学院
第一节 限制性核酸内切酶
同尾酶举例： 如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重 组分子能被 MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识 别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATC BamHI和 BglII(AGATCT) 两种酶产生的相容性末端，相连 后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
生命科学学院
HindⅢ切割位点
DNA
HindⅢ
AA G C T T T T C G AA
免疫系统 限制/修饰系统
(R-M, Restriction-modification system)
生命科学学院
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象
修饰的phage λ (B)
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
EOP=1（修饰作用）
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 寄主控制的限制与修饰的作用 一是保护自身的DNA不受限制；
二是破坏外源DNA使之迅速降解。
基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。 K12： rk+mk+ rk-mk- （用于转化实验） rk-mk+ （用于转化实验） rk+mk-（自杀型表型）
DNA A A TTCGA B AGCTT A C D
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
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第一节 限制性核酸内切酶
3. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)， 但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 •
EcoP1: AGACC
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回 文序列）。与DNA的来源无关。
•
A B C C’ B’ A’ 或 A’ B’ C’ C B A
A B N
B’ A’ 或
A B B’ A’ A B B’ A’
A’ B’ N’ B A
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第一节 限制性核酸内切酶
（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末 端（blunt end）。如：
hsdS :编码产物协助上述两种酶行使相应功能 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内 切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖
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第一节 限制性核酸内切酶
三、限制性内切酶的命名
Escherichia
Coli
Ry13
EcoBiblioteka Baidu I
属名 第三个字母。 种名 株系 编号 若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
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第一节 限制性核酸内切酶
四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性 （一）识别序列 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多 数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性
注： SAM为S－腺苷甲硫氨酸
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第一节 限制性核酸内切酶
1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B 株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象
修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成 后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从 而免遭自身限制性酶的破坏。
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗 传物质和外来遗传物质的目的。 •
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第一节 限制性核酸内切酶
三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名 原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字 母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复 系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)。
第一节 限制性核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶
二、限制性内切酶的类型
限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型三类。
基因工程中使用 主要特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型
EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
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第一节 限制性核酸内切酶
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
主要特性 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 Ⅰ型 多功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割 Ⅱ型 单一功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割 Ⅲ型 双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游2426bp处 随机性切割
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系 类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解 掉。
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第一节 限制性核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的 作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受 到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿 主遗传稳定的保护机制。
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第二章 基因工程的酶学基础
基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一 些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为 工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这 些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生 物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的 酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修 复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己 和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握 了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得 了最好的基因工程工具。
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第二章
第一节
基因工程的酶学基础
限制性核酸内切酶
第二节
第三节 第四节 第五节 第六节
DNA连接酶
DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶
第七节
RNA酶
核酶（补充） 甲基化酶(补充)
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第一节 限制性核酸内切酶
任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
2. 3’突出的末端
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第一节 限制性核酸内切酶
粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
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第一节 限制性核酸内切酶
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 •
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 与限制与修饰系统相关的三个连锁基因： hsdR:编码限制性核酸内切酶 hsdM :编码DNA甲基化酶
大部分的大肠杆菌菌株含有3个位点特异的DNA甲基化酶。由dam基因 编码的甲基化酶把5—腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到序列GATC上的腺苷酸 N6位置上。而dcm基因编码的甲基化酶在C5位置修饰序列CCAGG和CCTGG 内部的胞嘧啶残基。
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第一节 限制性核酸内切酶
五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时， 使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5
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第一节 限制性核酸内切酶
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第一节 限制性核酸内切酶
3. 平头末端 •
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第一节 限制性核酸内切酶
四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性
（一）切割方式 同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸 内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。但有些同 裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生 相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地 更大(相容性末端)。 常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一 组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC 4个核苷酸组成的粘性 末端 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共 价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
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第一节 限制性核酸内切酶
四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性 （一）切割方式 Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键 中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生 3种不同的切口。
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第一节 限制性核酸内切酶
1. 5’突出的末端
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第一节 限制性核酸内切酶
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
多功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游2426bp处 随机性切割
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第一节 限制性核酸内切酶
（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开 一条单链。
Recognize site 1-1.5kb
cut
（3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
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第一节 限制性核酸内切酶
2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血 菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ
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第一节 限制性核酸内切酶
修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护， 不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引 入甲基 •
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5bp
6bp
11bp 12bp
HpaⅠ C CGG HaeⅢ GG CC AvaⅡ G GWCC EcoRⅡ CCWGG BamHⅠ G GATTC SmaⅠ CCC GGG Bg1Ⅰ GCCNNNN NGGC BstXⅠ CCANNNNN NTGC N=A, T, G, C
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第一节 限制性核酸内切酶
同尾酶举例： 如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重 组分子能被 MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识 别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATC BamHI和 BglII(AGATCT) 两种酶产生的相容性末端，相连 后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 产生粘性末端 EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
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HindⅢ切割位点
DNA
HindⅢ
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免疫系统 限制/修饰系统
(R-M, Restriction-modification system)
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象
修饰的phage λ (B)
EOP=10-4（限制作用）
大肠杆菌B
大肠杆菌K
EOP=10-4（限制作用） 修饰的phage λ (K)
EOP=1（修饰作用）
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 寄主控制的限制与修饰的作用 一是保护自身的DNA不受限制；
二是破坏外源DNA使之迅速降解。
基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。 K12： rk+mk+ rk-mk- （用于转化实验） rk-mk+ （用于转化实验） rk+mk-（自杀型表型）
DNA A A TTCGA B AGCTT A C D
核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用
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第一节 限制性核酸内切酶
3. III类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游24-26bp)， 但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 •
EcoP1: AGACC
（1）识别位点序列
未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回 文序列）。与DNA的来源无关。
•
A B C C’ B’ A’ 或 A’ B’ C’ C B A
A B N
B’ A’ 或
A B B’ A’ A B B’ A’
A’ B’ N’ B A
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（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末 端（blunt end）。如：
hsdS :编码产物协助上述两种酶行使相应功能 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内 切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖
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第一节 限制性核酸内切酶
三、限制性内切酶的命名
Escherichia
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属名 第三个字母。 种名 株系 编号 若种名头 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和
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第一节 限制性核酸内切酶
四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性 （一）识别序列 识别顺序的碱基数一般为4-6 bp，少数识别更长，多 数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位 点在切割位点之外，具旋转对称性
注： SAM为S－腺苷甲硫氨酸
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第一节 限制性核酸内切酶
1. I型限制性内切酶 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B 株和 K株分离的。 如 EcoB和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
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第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象
修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成 后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从 而免遭自身限制性酶的破坏。
修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗 传物质和外来遗传物质的目的。 •
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三、限制性内切酶的命名 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名 原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字 母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复 系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)。
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第一节 限制性核酸内切酶
二、限制性内切酶的类型
限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修 饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型三类。
基因工程中使用 主要特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型
EcoP15: CAGCAG
在基因工程操作中用途不大。
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核酸限制性内切酶的类型及主要特性
主要特性 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 Ⅰ型 多功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割 Ⅱ型 单一功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割 Ⅲ型 双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游2426bp处 随机性切割
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓 的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系 类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解 掉。
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一、寄主的限制与修饰现象 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的 作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受 到限制。 限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿 主遗传稳定的保护机制。
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第二章 基因工程的酶学基础
基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一 些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为 工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这 些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生 物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的 酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修 复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己 和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握 了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得 了最好的基因工程工具。
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第二章
第一节
基因工程的酶学基础
限制性核酸内切酶
第二节
第三节 第四节 第五节 第六节
DNA连接酶
DNA聚合酶和反转录酶 DNA修饰酶 外切核酸酶 单链内切核酸酶
第七节
RNA酶
核酶（补充） 甲基化酶(补充)
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任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制
2. 3’突出的末端
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粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
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ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 •
第一节 限制性核酸内切酶
一、寄主的限制与修饰现象 与限制与修饰系统相关的三个连锁基因： hsdR:编码限制性核酸内切酶 hsdM :编码DNA甲基化酶
大部分的大肠杆菌菌株含有3个位点特异的DNA甲基化酶。由dam基因 编码的甲基化酶把5—腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到序列GATC上的腺苷酸 N6位置上。而dcm基因编码的甲基化酶在C5位置修饰序列CCAGG和CCTGG 内部的胞嘧啶残基。
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五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时， 使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5
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3. 平头末端 •
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四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性
（一）切割方式 同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸 内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。但有些同 裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生 相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地 更大(相容性末端)。 常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、 BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一 组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC 4个核苷酸组成的粘性 末端 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共 价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
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四、 Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性 （一）切割方式 Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键 中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生 3种不同的切口。
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1. 5’突出的末端
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第一节 限制性核酸内切酶
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
多功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源三聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近 特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游2426bp处 随机性切割
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第一节 限制性核酸内切酶
（2）切割位点 在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开 一条单链。
Recognize site 1-1.5kb
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（3）作用机理 需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
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2. II类限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血 菌中分离出来。 分离的第一个酶是Hind Ⅱ
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第一节 限制性核酸内切酶
修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护， 不能被自身的限制性内切酶识别切割。 ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引 入甲基 •
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