蛋白质印迹(Western blot)样品制备

蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。目录

∙裂解缓冲液

∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂

∙制备细胞培养物裂解物

∙制备组织裂解物

∙测定蛋白质浓度

∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品

裂解缓冲液

不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。

选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。

裂解缓冲液配方：

NP-40 缓冲液

∙150 mM 氯化钠

∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）

∙50 mM Tris，pH 8.0

这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。

RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）

∙ 150 mM 氯化钠

∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100

∙0.5% 脱氧胆酸钠*

∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）

∙50 mM Tris，pH 8.0

*可制备成10% 的母液，避光保存。

RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含

NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。

如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用Dounce 匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用Tris 缓冲液即可，但如前文所述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。

Tris-HCl 缓冲液

∙ 20 mM Tris-HCl，pH 7.5

Tris-Triton 缓冲液（细胞骨架蛋白）

∙10 mM Tris，pH 7.4

∙100 mM NaCl

∙ 1 mM EDTA

∙ 1 mM EGTA

∙1% Triton X-100

∙10% 甘油

∙0.1% SDS

∙0.5% 脱氧胆酸盐

以上4 种缓冲液可在4 ℃下保存数周，分装之后可在-20 ℃下储存长达1 年。

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。始终将样品置于冰上或维持在4 ℃下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。

许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，但您也可以自行制备抑制剂混合物。

制备原钒酸钠

所有步骤均在通风橱中进行。

1. 用双蒸水制备100 mM 原钒酸钠溶液。

2. 用HCl 将pH 调节至9.0。

3. 煮沸至无色。稍微盖住溶液，尽量减小由蒸发造成的体积变化。

4. 冷却至室温。

5. 再次将pH 调节至9.0。

6. 煮沸至无色。

7. 重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的pH 保持9.0。

8. 用水补至初始体积。

9. 分装之后保存于-20 ℃。如果样品变黄，丢弃样品。

制备细胞培养物裂解物

1. 将细胞培养皿置于冰上，用预冷的PBS 洗涤细胞。

2. 吸出PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（每107细胞/100 mm 培养皿/150

cm2培养瓶加入1 mL；每5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入0.5 mL）。

3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微

量离心管中。或者，也可先用胰蛋白酶处理细胞并用PBS 洗涤，再用裂解缓冲液在微量离心管中悬浮细胞。

4. 在4 ℃下以恒定速率搅拌30 分钟。

5. 4 ℃下在微型离心机中离心。您可能需要根据不同的细胞类型调整离心力和离心

时间；建议以12,000 rpm 离心20 分钟，但具体设置须根据您的实验确定（例如，离心白细胞时应采用较为温和的离心设置）。

6. 轻轻地从离心机中取出离心管并置于冰上，吸取上清液并转移至放置在冰上的新

离心管中，弃去沉淀。

制备组织裂解物

1. 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止

样品被蛋白酶降解。

2. 将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行速冻。将样

品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。

3. 对于约5 mg 的组组，向离心管中快速加入约300 μL 预冷的裂解缓冲液，然后

用电动匀浆器进行匀浆，用另外2x 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌2 小时（例如，置于冰箱中的回旋振荡器上）。裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。蛋白质提取物不应过度稀释，避免蛋白质损失和凝胶上样体积过大。

我们推荐的最低浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1–5 mg/mL。

4. 使用微量离心机在4 ℃下以12000 rpm 离心20 分钟。从离心机中轻轻地取出

离心管，将其置于冰上，吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中。弃去沉淀。

确定蛋白质浓度

1. 进行Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸(BCA) 分析。通常使用牛血清

蛋白(BSA) 作为蛋白质标准品。