蛋白质印迹(Western blot)样品制备
Western Blot实验指导教程
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。
配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。
5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。
8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。
二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。
室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。
（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。
室温下保存。
（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。
蛋白质印迹(Western blot)样品制备
蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。
目录∙裂解缓冲液∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂∙制备细胞培养物裂解物∙制备组织裂解物∙测定蛋白质浓度∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品裂解缓冲液不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。
选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。
如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。
裂解缓冲液配方：NP-40 缓冲液∙150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）∙50 mM Tris，pH 8.0这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。
如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）∙ 150 mM 氯化钠∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100∙0.5% 脱氧胆酸钠*∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）∙50 mM Tris，pH 8.0*可制备成10% 的母液，避光保存。
RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。
但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法（Western Blot）是一种常用于检测蛋白质的方法。
其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。
1. 样品制备：首先，待检样品经过蛋白质提取，然后经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。
2. 蛋白转膜：随后，将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物（如聚偏氟乙烯）膜上，形成蛋白质膜。
3. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清白蛋白）的缓冲液中，阻止非特异性结合。
4. 抗体结合：将膜与特异性抗体一起孵育，抗体与目标蛋白质特异性结合。
这些抗体通常是经过免疫动物制备，针对目标蛋白质的特定抗原位点。
5. 靶蛋白检测：使用荧光标记或酶标记的二抗（即与第一抗体结合的抗体）与第一抗体结合。
这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。
6. 信号检测：使用荧光标记物或底物，通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。
常用方法是使用化学发光底物，比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。
通过这个原理，蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。
它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。
蛋白质印迹法
蛋白印迹法（Western-blot）一、基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。
已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。
其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。
本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。
WB的原理如下。
Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS —PAGE）法分离蛋白质。
SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。
无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为：1g 。
同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。
另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和ß-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。
分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。
用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。
能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
simple western 原理
simple western 原理Western blotting（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，它可以通过印迹将蛋白质从复杂的样品中分离出来，并在膜上进行检测和分析。
Western blotting有多种不同的实施方法，其中simple western是一种简单且实用的方法，它通常用于研究微量蛋白质的表达水平。
简单西方的原理主要基于蛋白质的固相放射自显影技术。
在此过程中，蛋白质样品首先被印迹到支持物（如硝酸纤维素膜）上，然后与标记的抗体结合，形成免疫复合物。
接着，这些复合物会在支持物上形成可见的放射性图像，从而显示出蛋白质的存在和位置。
具体步骤如下：1. 样品制备：首先，需要从样品中提取蛋白质，并进行定量。
样品可以是组织、细胞、血清或其他生物样本。
2. 印迹：将蛋白质样品印迹到硝酸纤维素膜或其他支持物上。
这一步通常使用湿法转印或干法转印技术。
3. 标记：将放射性标记的抗体与印迹在支持物上的蛋白质复合物结合，标记的抗体可以与蛋白质上的抗原表位特异性结合。
4. 结合和检测：将支持物放入暗盒中，加入标记的抗体和适当的垫圈液进行结合。
通过放射自显影技术，可以检测到放射性标记的蛋白质复合物。
5. 分析：通过观察和分析自显影图像，可以确定蛋白质的存在、相对丰度、位置和相对表达水平。
简单西方的优点在于其简单、快速、成本低廉和可扩展性。
此外，由于不需要使用复杂的化学发光或荧光检测方法，simple western适用于研究微量蛋白质的表达水平，特别是对于那些难以制备大量标准品的蛋白质样品。
然而，simple western也存在一些局限性。
首先，其检测灵敏度受到放射性标记的限制，对于低丰度蛋白质的检测可能存在难度。
其次，由于依赖于放射性物质，simple western可能存在潜在的辐射危害和废物处理问题。
此外，由于需要人工分析自显影图像，simple western在自动化和标准化方面可能存在挑战。
westernblot原理及步骤
Western blot的原理1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
具体可看westernblot 原理3.步骤（一）蛋白样品制备培养的细胞（定性）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
western blot蛋白样品制备原理
Western blot是一种常用的蛋白质分析方法，它可以用于检测特定蛋白质在样品中的存在和数量。
Western blot的实验流程包括样品制备、电泳分离、转膜和蛋白质检测。
其中，样品制备是整个实验的关键步骤之一，下面就让我们来详细了解一下Westernblot蛋白样品制备原理。
一、样品的选择在进行Western blot实验前，首先需要选择合适的样品。
一般来说，样品可以是细胞、组织或者体液等。
在选择样品时，需要考虑到样品来源、样品数量和样品纯度等因素。
如果样品来源不同，那么制备样品的方法也会有所不同。
例如，对于细胞和组织样品，可以通过细胞裂解和组织切片等方法来制备样品；对于体液样品，可以通过离心等方法来制备样品。
二、蛋白的提取在样品制备的过程中，需要将目标蛋白从样品中提取出来。
蛋白的提取方法有很多种，其中比较常用的方法包括化学法、机械法和生物学法等。
化学法包括使用洗涤剂、有机溶剂、酸碱等物质来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
机械法包括使用超声波、研钵等工具来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
生物学法则是利用生物学技术，如细胞裂解酶等，来破坏细胞膜，从而释放蛋白质。
三、蛋白的分离在蛋白提取后，需要将蛋白进行分离，以便进行后续的Western blot实验。
蛋白的分离方法有很多种，其中比较常用的方法包括凝胶电泳和液相色谱等。
凝胶电泳是一种将蛋白质按照其分子量大小进行分离的方法，常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
液相色谱则是一种将蛋白质按照其化学性质进行分离的方法，常用的液相色谱有离子交换色谱和逆相色谱等。
四、蛋白的转膜在蛋白分离后，需要将蛋白转移到膜上进行Western blot检测。
转膜的方法有很多种，其中比较常用的方法包括湿式转膜和干式转膜等。
湿式转膜是将蛋白质通过电泳转移到膜上的方法，需要使用电泳缓冲液和转膜装置等。
干式转膜则是将蛋白质通过电泳转移到膜上的方法，需要使用转膜装置和干燥器等。
五、蛋白的检测在蛋白转膜后，需要进行Western blot检测。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
western blot法的方法
western blot法的方法
Western blot法是一种常用的蛋白质检测方法，用于检测特定蛋白质在混合蛋白中的存在和相对量。
它结合了凝胶电泳和免疫学技术，能够检测蛋白质的分子量，以及是否存在翻译后修饰等信息。
Western blot法主要分为以下步骤：
1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品通过凝胶电泳分离出来，然后转移到聚丙烯酰胺膜上。
也可以直接使用细胞裂解液或组织匀浆作为样品。
2. 膜的处理：将转移膜进行处理，包括预处理、阻断和特异性抗原结合等步骤。
预处理包括用甲醛或其它交联剂固定膜上的蛋白质，并使用一些化学物质使膜具有更好的特异性。
阻断可以使用牛血清蛋白或其它蛋白质，防止非特异性的抗体结合。
特异性抗原结合则是将一种特异性抗体与待检测的蛋白质结合。
3. 二级抗体检测：将与特异性抗体结合的膜，加入与其结合的二级抗体。
这种二级抗体上标记有一种酶或荧光素，当其结合到特异性抗体上时，可以通过化学或荧光反应进行检测。
4. 结果分析：通过化学或荧光反应的结果，可以确定待测蛋白的存
在和相对量。
一般通过分子量大小来确定特定蛋白的存在，并且通过对标准样品进行比较，来确定蛋白质的相对量。
需要注意的是，在进行Western blot法的过程中，应该正确选择抗体和对应的检测方法，以保证检测结果的准确性。
此外，在样品制备和转移膜的过程中也需要严格控制条件，以避免对结果的影响。
Western blot法在生物医学研究中有着广泛的应用，可以检测不同生物过程中的蛋白质表达情况，如疾病的发生和发展过程中的蛋白质变化，以及药物治疗对蛋白质表达的影响等。
蛋白印实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质印迹实验的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用蛋白质印迹实验检测目的蛋白的表达水平。
3. 掌握Western Blot实验的试剂配制、操作及结果分析。
二、实验原理蛋白质印迹实验（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测方法，通过抗原抗体反应检测样品中特定蛋白的表达水平。
实验原理如下：1. 将待测样品进行SDS-PAGE电泳，分离蛋白质。
2. 将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上。
3. 用一抗（针对目的蛋白的抗体）与NC膜上的蛋白质结合。
4. 用二抗（针对一抗的酶标抗体）与一抗结合，通过酶催化底物显色，观察目的蛋白的表达水平。
三、实验材料1. 试剂：SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、转移缓冲液、封闭液、一抗、二抗、底物、显色液等。
2. 仪器：电泳仪、转膜仪、显影仪、凝胶成像系统等。
3. 样品：待测组织或细胞裂解物。
四、实验步骤1. 准备SDS-PAGE凝胶，加样，进行电泳分离蛋白质。
2. 将电泳后的蛋白质转移到NC膜上，室温下放置30分钟。
3. 将NC膜放入封闭液中，室温下封闭1小时。
4. 将NC膜放入一抗溶液中，4℃下孵育过夜。
5. 将NC膜放入二抗溶液中，室温下孵育1小时。
6. 用底物显色，用显影仪观察结果，记录目的蛋白的表达水平。
五、结果分析1. 观察Western Blot结果，分析目的蛋白的表达水平。
2. 与阴性对照和阳性对照比较，确定目的蛋白的表达状态。
3. 根据目的蛋白的分子量，判断其表达水平是否符合预期。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 选择合适的抗体和底物，确保实验结果的准确性。
3. 根据实验目的，优化实验条件，提高实验成功率。
七、实验总结蛋白质印迹实验是一种有效的蛋白质检测方法，通过抗原抗体反应检测样品中特定蛋白的表达水平。
本实验成功实现了目的蛋白的检测，为后续研究提供了有力支持。
在实验过程中，我们掌握了Western Blot实验的操作步骤和注意事项，为今后的研究打下了基础。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
western blot实验内容
western blot实验内容Western Blot实验内容可以简单描述为一种生物化学分析技术，主要用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的存在和表达水平。
该实验通常包括以下步骤：1. 样品制备：首先，从细胞培养物或组织中提取蛋白质。
这可以通过细胞裂解和蛋白质提取试剂盒等方法来完成。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品通过SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。
在SDS-PAGE中，样品中的蛋白质按照大小被分离成不同的带状条带。
3. 转印：将分离的蛋白质通过电泳转印技术转移到聚丙烯酰胺薄膜（或称为膜）上。
膜可以是尼龙膜或聚乙烯膜。
4. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白或脱脂奶粉）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将膜与特异性抗体（一抗）一起在某种缓冲液中孵育。
这些一抗可以结合到目标蛋白质上。
6. 洗涤：通过多次洗涤，去除与一抗非特异性结合的蛋白质。
7. 二抗孵育：膜与与一抗的物种不同的次级抗体（二抗）一起在缓冲液中孵育。
二抗与一抗结合，形成复合物。
8. 洗涤：去除与二抗非特异性结合的蛋白质。
9. 显色：将特定酶底物添加到膜上，使目标蛋白质变色。
例如，常用的酶底物是辣根过氧化物酶（HRP）和4-氨基乙基硅烷（DAB），可以生成棕色的色斑。
10. 图像获取和分析：使用相应的设备（如基于膜的成像系统）捕捉膜的图像，并使用分析软件定量分析蛋白质的表达水平。
通过Western Blot实验，研究人员能够检测和定量不同细胞组分中蛋白质的存在和表达水平，从而深入了解生物系统的功能和调控机制。
蛋白印记操作流程
蛋白印记操作流程
蛋白印记（WesternBlot）是一种常用的生物学实验技术，主要用于检测和分析蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
以下是蛋白印记的基本操作流程：
样品制备：首先，从细胞或组织中提取蛋白质。
对于细胞样品，通常需要将细胞破碎并溶解在裂解液中。
对于组织样品，可能需要将组织切成小块并加入预冷的裂解液进行匀浆。
然后，通过离心去除细胞碎片或未溶解的组织残渣，收集上清液作为蛋白质样品。
蛋白质定量：接着，对提取的蛋白质进行定量。
这可以通过使用蛋白质定量试剂盒或分光光度计等方法来完成。
蛋白质定量的准确性对于后续的实验步骤至关重要。
SDS-PAGE电泳：将定量后的蛋白质样品与SDS-PAGE上样缓冲液混合，并在一定温度下预热。
然后，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
电泳过程中，蛋白质会根据其分子量大小在凝胶中分离。
转膜：电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上。
这一步通常通过电泳或真空转移法完成。
免疫检测：转膜后，使用特定的抗体与膜上的蛋白质进行免疫反应。
这通常包括一抗孵育、洗涤、二抗孵育和再次洗涤等步骤。
一抗是针对目标蛋白质的特异性抗体，而二抗则是与一抗结合的标记抗体，用于后续的显色反应。
显色与结果分析：最后，通过显色反应（如化学发光或荧光检测）来可视化抗体与蛋白质的结合情况。
根据显色结果，可以分析目标蛋白质在样品中的表达水平和分布情况。
整个操作流程需要严格遵循实验规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，还需要注意实验过程中的安全事项，如佩戴防护眼镜和手套等。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot，又称免疫印迹法，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
它能够通过识别蛋白质在膜上的位置来确定其分子量，并且可以检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能够帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检测的蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到膜上。
接着，膜上的蛋白与特异性抗体结合，再经过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在和表达水平。
2. 步骤。
（1）蛋白样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液，使其蛋白质变性并带有负电荷，然后进行蛋白定量。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳分离，使蛋白质按照大小分子量在凝胶中迁移。
（3）蛋白转膜，将分离后的蛋白转移到膜上，通常使用的是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
转膜的方法有湿式转膜和半干式转膜两种。
（4）膜上抗体结合，将蛋白转膜后的膜进行封闭，然后与特异性的一抗抗体结合，再与辅助抗体结合。
（5）信号检测，通过化学发光或染色等方法来检测膜上蛋白的存在和表达水平，如辣根过氧化物酶（HRP）发光、碱性磷酸酶（AP）发光、共价结合荧光素等。
3. 注意事项。
（1）蛋白样品制备要避免蛋白降解和失活，通常在样品中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳要注意电泳条件的选择，如电压、时间和电流密度等。
（3）蛋白转膜后的膜要保持湿润，避免膜的干燥和破裂。
（4）抗体结合和信号检测要根据实验需要选择合适的抗体和检测方法，以确保结果的准确性和可靠性。
4. 应用。
Western blot广泛应用于生物医学研究中，如检测蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质、研究蛋白质相互作用等。
蛋白质免疫印迹实验步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤1. 引言嘿，大家好！今天我们要聊聊一个非常酷炫的实验——蛋白质免疫印迹实验，或者说西方印迹（Western Blot）。
听名字就很高大上对吧？其实就是用来检测特定蛋白质的。
想象一下，你在寻找一颗珍珠，蛋白质就是那颗珍珠，而免疫印迹就是我们的寻宝地图。
别担心，我会一步一步带你走过这条寻宝之路，让我们开始吧！2. 实验准备2.1 材料准备首先，准备好你的材料，这一步可马虎不得哦。
你需要的东西包括样品（这可以是细胞、组织、甚至是你那杯牛奶），裂解缓冲液、凝胶电泳设备、转膜设备、封闭液、抗体（这个可不能少！），还有洗涤液和显色试剂。
听起来有点像是做饭，其实是很简单的，像是在调配一碗美味的汤。
2.2 样品处理接下来，我们要处理样品。
把你的样品和裂解缓冲液混合，轻轻摇晃，让它们充分融合。
接着，要把这些混合液放在冰上静置一段时间，简直就是在给它们来个冷静期，让蛋白质们沉淀下来。
然后，咱们要通过离心机把细胞的碎片和其他杂质去掉。
小心别把珍珠也扔了，哈哈！3. 电泳分离3.1 凝胶制备哎呀，这时候就要准备凝胶了。
其实凝胶就像是个筛子，能让小的蛋白质通过，而大的蛋白质则被挡住。
我们一般用聚丙烯酰胺凝胶，先把它溶解，放到模具里，等它固化。
固化的时候可以去喝杯茶，顺便欣赏一下这小小的“魔法”。
3.2 电泳运行凝胶固化好后，就可以把样品上胶了。
注意哦，别搞得稀里糊涂，把样品挤到槽里。
然后把凝胶放进电泳池，接上电源，开跑！这就像在赛道上，蛋白质们各显神通，争先恐后。
别着急，等到它们跑到适当的地方，再把它们捞出来。
4. 转膜步骤4.1 转膜跑完电泳，接下来是个关键步骤——转膜。
把凝胶和膜叠在一起，放在转膜装置里，接上电源，让蛋白质们转移到膜上。
就像是把书里的内容复制到你的笔记本上，确保每个细节都不漏掉。
转膜的过程可能需要一段时间，但别担心，慢工出细活嘛！4.2 封闭和抗体孵育转完膜后，我们要进行封闭。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
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蛋白质印迹（Western blot）样品制备蛋白质印迹样品制备，包括裂解缓冲液、细胞培养物裂解物、组织裂解物的制备以及蛋白质浓度的测定。
目录
∙裂解缓冲液
∙蛋白酶和磷酸酶抑制剂
∙制备细胞培养物裂解物
∙制备组织裂解物
∙测定蛋白质浓度
∙制备用于凝胶上样的样品：变性样品和天然样品，还原样品和非还原样品
裂解缓冲液
不同裂解缓冲液溶解蛋白质的能力各不相同，其中含有十二烷基硫酸钠(SDS) 和其它离子去污剂的裂解缓冲液被认为具有最强的溶解能力，因此最有可能获得最高得率。
选择裂解缓冲液的主要考虑因素是确保所选抗体能够识别变性样品。
如果抗体无法识别变性样品，抗体数据表会加以说明，这种情况下应使用不含去污剂或含有相对温和的非离子去垢剂(NP-40、Triton X-100) 的裂解缓冲液。
裂解缓冲液配方：
NP-40 缓冲液
∙150 mM 氯化钠
∙ 1.0% NP-40（可用Triton X-100 替代NP-40）
∙50 mM Tris，pH 8.0
这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。
如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解。
RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）
∙ 150 mM 氯化钠
∙ 1.0% NP-40 或Triton X-100
∙0.5% 脱氧胆酸钠*
∙0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）
∙50 mM Tris，pH 8.0
*可制备成10% 的母液，避光保存。
RIPA 缓冲液适用于全细胞提取物和膜结合蛋白，而且其提取细胞核蛋白的效果比仅含
NP-40 或Triton X-100 的缓冲液的效果更好。
但它会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如Triton X-100）。
使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用Dounce 匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。
这些情况下使用Tris 缓冲液即可，但如前文所述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。
Tris-HCl 缓冲液
∙ 20 mM Tris-HCl，pH 7.5
Tris-Triton 缓冲液（细胞骨架蛋白）
∙10 mM Tris，pH 7.4
∙100 mM NaCl
∙ 1 mM EDTA
∙ 1 mM EGTA
∙1% Triton X-100
∙10% 甘油
∙0.1% SDS
∙0.5% 脱氧胆酸盐
以上4 种缓冲液可在4 ℃下保存数周，分装之后可在-20 ℃下储存长达1 年。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂
一旦样品开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。
始终将样品置于冰上或维持在4 ℃下，并且一开始就向裂解缓冲液中加入合适的抑制剂，能够显著减缓这些反应。
许多供应商都提供即用型抑制剂混合物，但您也可以自行制备抑制剂混合物。
制备原钒酸钠
所有步骤均在通风橱中进行。
1. 用双蒸水制备100 mM 原钒酸钠溶液。
2. 用HCl 将pH 调节至9.0。
3. 煮沸至无色。
稍微盖住溶液，尽量减小由蒸发造成的体积变化。
4. 冷却至室温。
5. 再次将pH 调节至9.0。
6. 煮沸至无色。
7. 重复以上循环，直到煮沸并冷却溶液之后的pH 保持9.0。
8. 用水补至初始体积。
9. 分装之后保存于-20 ℃。
如果样品变黄，丢弃样品。
制备细胞培养物裂解物
1. 将细胞培养皿置于冰上，用预冷的PBS 洗涤细胞。
2. 吸出PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（每107细胞/100 mm 培养皿/150
cm2培养瓶加入1 mL；每5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入0.5 mL）。
3. 用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微
量离心管中。
或者，也可先用胰蛋白酶处理细胞并用PBS 洗涤，再用裂解缓冲液在微量离心管中悬浮细胞。
4. 在4 ℃下以恒定速率搅拌30 分钟。
5. 4 ℃下在微型离心机中离心。
您可能需要根据不同的细胞类型调整离心力和离心
时间；建议以12,000 rpm 离心20 分钟，但具体设置须根据您的实验确定（例如，离心白细胞时应采用较为温和的离心设置）。
6. 轻轻地从离心机中取出离心管并置于冰上，吸取上清液并转移至放置在冰上的新
离心管中，弃去沉淀。
制备组织裂解物
1. 用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止
样品被蛋白酶降解。
2. 将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行速冻。
将样
品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。
3. 对于约5 mg 的组组，向离心管中快速加入约300 μL 预冷的裂解缓冲液，然后
用电动匀浆器进行匀浆，用另外2x 300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌2 小时（例如，置于冰箱中的回旋振荡器上）。
裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织数量确定。
蛋白质提取物不应过度稀释，避免蛋白质损失和凝胶上样体积过大。
我们推荐的最低浓度为0.1 mg/mL，最佳浓度为1–5 mg/mL。
4. 使用微量离心机在4 ℃下以12000 rpm 离心20 分钟。
从离心机中轻轻地取出
离心管，将其置于冰上，吸出上清液并将其注入置于冰上的洁净管中。
弃去沉淀。
确定蛋白质浓度
1. 进行Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸(BCA) 分析。
通常使用牛血清
蛋白(BSA) 作为蛋白质标准品。
2. 确定每个样品的浓度之后，可将其冻存于-20 ℃或-80 ℃以备后续使用，或以
备进行免疫沉淀分析或以备凝胶上样。
制备用于凝胶上样的样品
变性、还原样品
抗体通常识别目标蛋白的一小部分（被称为“表位”），这一结构域可能位于蛋白质的三维结构内。
要使抗体能够接近该部分，必须使蛋白质展开，即使其变性。
要使蛋白质变性，加入含阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS) 的上样缓冲液，并在
95–100 ℃下煮沸混合物5 分钟。
也可在70 ℃下加热混合物5–10 分钟，这种处理方式适用于多次跨膜蛋白研究。
煮沸处理使膜蛋白质聚集，而蛋白质聚集体无法有效进入凝胶中。
标准的上样缓冲液被称为2× Laemmli 缓冲液（Laemmli UK, 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bateriophage T4.Nature, 227, 680–5)。
也可将其制备成4×和6×缓冲液，以尽量降低样品的稀释度。
2×缓冲液应按照1:1 的比例与样品混合。
2× Laemmli 缓冲液配方
∙4% SDS
∙10% 2-巯基乙醇
∙20% 甘油
∙0.004% 溴酚蓝
∙ 0.125 M Tris HCl
∙测定pH 值并将pH 调整为6.8
用SDS 处理蛋白质时，所有蛋白质都附着在SDS 阴离子上并因此带负电荷。
SDS 和蛋白质以1.4:1 的质量比特异性地结合，因此SDS 赋予多肽的负电荷与其长度成正比。
变性的多肽变为带负电荷的“棒”，且单位长度的电荷密度相等。
因此，多肽的迁移取决于多肽的分子量，而不是多肽的固有电荷。
SDS 的纯度对于实现高质量的蛋白质分离至关重要：如果整块凝胶的蛋白质染色背景中的蛋白质条带模糊不清或只能勉强看清，表明所用的SDS 过于陈旧或质量不佳。
向缓冲液中加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇能减少二硫键，这对于根据分子大小进行的蛋白质分离十分必要。
向上样缓冲液中加入甘油可增加待上样样品的密度，从而将样品维持在样品孔底部，避免样品外溢和凝胶中上样不均匀。
为了使蛋白质的迁移可见，通常要向上样缓冲液中加入小分子阴离子染料（例如溴酚蓝）。
由于染料为阴离子且分子较小，它的迁移速度比混合物中所有待分离的组分都快，因此提供了可监测分离进程的迁移前沿。
处理蛋白质样品的过程中，加热步骤前后都应涡旋混合样品，以使蛋白质的分辨率达到最佳。
天然、非还原样品
某些抗体可识别由不连续氨基酸组成的表位。
虽然组成表位的氨基酸在一级序列中相互分离，但它们在蛋白质的折叠三维结构中相互靠近，抗体只能识别折叠结构表面上的表位。