限制性内切酶原理

DNA的甲基化程度
识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会 严重影响酶的催化效率。
为避免这样的问题，在基因克隆中使用的质 粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提 取的。
酶切消化反应的温度
不同的限制酶具有不同的最适反应温度。 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是 37℃，有些核酸内切限制酶的最适反应温度 低于标准的37℃，SmaI是25℃、ApaI是30℃； 有些高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、 BclI是50℃、MaelII是55℃。
DNA的纯度
限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程 度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂 中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、 SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制 酶的活性。
提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一 般采用三种方法：
①增加限制酶的用量。 ②扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑 制因素被相应地稀释） ③延长酶催化反应的保温时间。
命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
切割频率
切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性 核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。
前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、 碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每 个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。
限制酶的发现
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性 的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制 性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可 摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限 制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可 在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片 段。
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
3’粘性末端
5’NNNGC-OH NNN3‘
P-GGCCGC
3’NNNCGCCGG-P ‘
HO-CGNNN5
5’NNGGTAC-OH P-CNN3‘ 3’NNC-P HO-CATGGNN 5 ‘
同尾酶
切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末 端的一类限制性内切酶。
特殊的II型限制酶
有些限制酶识别的序列不是回文序列。
AccⅠ 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTAC
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
影响限制性酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）
粘性末端和平末端
II型限制酶切割DNA后形成粘性末端或平末端 分别由错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶 在基因工程中应用最多。
5’NNNGTT 3‘NNNCAA
AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC NNN3‘
GGCCGC
3’NNNCGCCGG
CGNNN5
‘
NotⅠ 的识别序列
如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每 隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为 n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
2
限制酶的种类
I型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基, 不能
准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。
II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因Βιβλιοθήκη Baidu程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
BamH I
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
Bgl Ⅱ Bcl I Xho Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
同裂酶
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷 酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切 割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但 切割位点不同的叫同序异切酶。 例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。 XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但 Xma I的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘 性末端；而Sma I的切点则在CCC^GGG，形成平 末端。
GAATATTC CTTATAAG
II型限制酶 ApaI BamHI BglII EcoRI HindIII KpnI NcoI NdeI NheI NotI SacI SalI SphI XbaI XhoI
识别序列： 5'GGGCC^C 3' 识别序列： 5' G^GATCC 3' 识别序列： 5' A^GATCT 3' 识别序列： 5' G^AATTC 3' 识别序列： 5' A^AGCTT 3' 识别序列： 5' GGTAC^C 3' 识别序列： 5' C^CATGG 3' 识别序列： 5' CA^TATG 3' 识别序列： 5' G^CTAGC 3' 识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' 识别序列： 5' GAGCT^C 3' 识别序列： 5' G^TCGAC 3' 识别序列： 5' GCATG^C 3' 识别序列： 5' T^CTAGA 3' 识别序列： 5' C^TCGAG 3'
II型限制酶
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限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序 列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为 使用。
限制性核酸内切酶
分布极广，几乎在所有 细菌的属、种中都发现 至少一种限制性内切酶。 细菌通过自身的限制酶， 破坏入侵的外源DNA， 从而保护自身。